峨眉山異葉天南星抗MRSA內(nèi)生細(xì)菌的篩選

唐梅 龔明福 管芩瀾 羅燕

摘要：從峨眉山采集異葉天南星（Arisema heterophyllum Blume）健康植株，采用平板涂布法從其根、莖、葉各組織分離純化內(nèi)生細(xì)菌，采用菌餅平板對(duì)峙培養(yǎng)法初步篩選抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的菌株，采用牛津杯法進(jìn)一步篩選抗性菌株。結(jié)果表明，可以從峨眉山異葉天南星根、莖、葉各組織中分離得到26株內(nèi)生細(xì)菌；初篩結(jié)果顯示，26株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA均有抗菌活性，其中平均抑菌圈直徑超過(guò)12 mm的有12株；復(fù)篩結(jié)果顯示，12株拮抗菌抗MRSA活性穩(wěn)定，與初篩結(jié)果無(wú)明顯差異，菌株YG009、YJ009抗MRSA活性最強(qiáng)，與其他菌株存在極顯著差異，有開(kāi)發(fā)抗MRSA新藥的潛力。

關(guān)鍵詞：異葉天南星；內(nèi)生細(xì)菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；峨眉山；篩選

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0388-02

異葉天南星（Arisema heterophyllum Blume）為天南星科天南星屬多年生草本植物，全國(guó)各地均有分布，主要以塊莖入藥[1]。相關(guān)研究結(jié)果表明，天南星科藥用植物在毒性、刺激性、藥用成分、藥理活性等很多方面的相似性可以達(dá)到80%以上[2]，因此異葉天南星具有與天南星科藥用植物相似的功效，且對(duì)驚厥等疾病有較好治療作用[3]。植物的內(nèi)生菌（endophyte）是指在一定或全部階段生活在健康植物組織內(nèi)部的微生物，普遍存在于高等植物中。內(nèi)生菌由于長(zhǎng)期生活在植物組織內(nèi)部而與植物和諧生長(zhǎng)，能夠產(chǎn)生與宿主植物所產(chǎn)生的相同或相似的活性化合物[4]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是臨床上常見(jiàn)的1種毒性比較強(qiáng)的細(xì)菌[5]，是金黃色葡萄球菌的1種，但能夠耐甲氧西林，可引起多種化膿性疾病。MRSA除了對(duì)甲氧西林有耐藥性外，還對(duì)臨床上應(yīng)用的多種抗生素具有耐藥性，所導(dǎo)致的感染呈暴發(fā)性或散發(fā)性流行，治療極其困難，致死率極高，成為全世界范圍內(nèi)抗感染的難題[6]。從藥用植物中篩選出抗MRSA的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)于預(yù)防和控制由MRSA引起的感染具有重要意義[7]。本研究從采自峨眉山的異葉天南星的根、莖、葉組織中分離內(nèi)生細(xì)菌，采用牛津杯法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA的抑菌活性，從中篩選抗MRSA活性強(qiáng)的菌株，為抗MRSA新藥篩選及峨眉山異葉天南星的保護(hù)及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年8月5日從峨眉山萬(wàn)年寺（海拔約800 m）附近采集健康的異葉天南星植株，采集后立即保存于袋內(nèi)，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。MRSA由峨眉山特色生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離

分別取健康異葉天南星的根、莖、葉5～10 g，用自來(lái)水沖洗表面的泥土等污物后用無(wú)菌水沖洗3～5次，再分別用有效氯含量為5%的次氯酸鈉消毒2 min、75%乙醇消毒 1 min、01%HgCl消毒5 min，再用無(wú)菌水沖洗3～5次后放入無(wú)菌攪拌機(jī)中打漿，粉碎的組織液置于無(wú)菌的三角瓶中備用。分別取最后1次沖洗液和粉碎的組織液各1 mL，稀釋10 000倍，涂布于NA平板培養(yǎng)基（蛋白胨0.3%、牛肉膏05%、NaC1 0.5%、葡萄糖0.5%、瓊脂1.8%～2.0%、pH值7.0）上，于 28 ℃ 下培養(yǎng)，逐日觀察。將挑取的單菌落劃線純化后接種至斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，之后于4 ℃保藏菌種。

1.3 異葉天南星拮抗性內(nèi)生細(xì)菌初篩

在NA平板上涂布接種100 μL MRSA培養(yǎng)液，將異葉天南星內(nèi)生細(xì)菌的菌餅（直徑7 ㎜）有菌面平整貼在平板表面，28 ℃培養(yǎng)2～3 d后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，即通過(guò)2次十字方位來(lái)測(cè)量同一抑菌圈的直徑，然后再將測(cè)得的2次數(shù)據(jù)求平均值，即為該內(nèi)生細(xì)菌抑菌圈的直徑。以無(wú)菌的培養(yǎng)基餅（直徑7 mm）代替內(nèi)生細(xì)菌接種作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 異葉天南星拮抗性內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩

為了獲得抑菌能力較穩(wěn)定、較強(qiáng)的菌株，將初篩獲得的活性菌株純培養(yǎng)后制成菌懸液。在NA培養(yǎng)基上涂布接種 100 μL MRSA培養(yǎng)液，涂布均勻，每個(gè)平板中等距離均勻插入3個(gè)牛津杯（直徑7 mm），每個(gè)牛津杯接種同種活性菌株菌懸液100 μL。28 ℃培養(yǎng)2～3 d后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。在牛津杯中注入100 μL無(wú)菌水代替活性菌株菌懸液接種作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 異葉天南星內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

采用組織液涂布分離方法從異葉天南星健康植株的根、莖、葉中共分離純化得到26株內(nèi)生細(xì)菌。其中從根中分離出9種菌株，編號(hào)依次為YG001-YG009；從莖中分離出11種菌株，編號(hào)依次為YJ001-YJ011；從葉中分離出6種菌株，編號(hào)依次為YY001-YY006。

2.2 抗MRSA內(nèi)生細(xì)菌初篩結(jié)果

將分離純化得到的26株異葉天南星的內(nèi)生細(xì)菌制成菌餅，然后采用平板對(duì)峙法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA的抑菌活性。結(jié)果表明，26株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA均有抑菌活性，但各菌株間抑菌活性存在較大差異（表1），其中平均抑菌圈直徑超過(guò)12 mm的菌株有12種，分別為YG009、YJ009、YJ004、YJ002、YJ006、YJ003、YG001、YG008、YJ011、YJ007、YY003、YY001，選取這12株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 抗MRSA內(nèi)生細(xì)菌復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩中抑菌直徑超過(guò)12 mm的12株菌株采用牛津杯法復(fù)篩，結(jié)果表明，12株菌株對(duì)MRSA均具有較高的抑菌活性（表2）。其中YG009、YJ009對(duì)MRSA的抑菌活性最強(qiáng)，與其他菌株差異極顯著。各菌株抑菌活性與初篩結(jié)果無(wú)明顯差異，表明各菌株抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)材料是從峨眉山海拔800 m左右的地方采集的天南星科健康植物異葉天南星，從根、莖、葉組織中共分離純化得到26株內(nèi)生細(xì)菌，這26株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA均有抑菌活性，但不同菌株抑菌活性存在差異。初篩中平均抑菌圈直徑超過(guò)12 mm的菌株有12株，這12株菌株在復(fù)篩中仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，其中YG009、YJ009對(duì)MRSA的抑菌活性最強(qiáng)，有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)抗MRSA新藥的潛力。

從健康植株異葉天南星根、莖、葉中分別分離得到內(nèi)生細(xì)菌，植株不同組織部位的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌MRSA的抑菌效果不同，從初篩、復(fù)篩結(jié)果來(lái)看，異葉天南星根、莖分離得到的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)MRSA的抑菌活性更強(qiáng)，這與異葉天南星主要以根入藥相吻合，同時(shí)表明莖可能也具有較好的藥用價(jià)值。

不同內(nèi)生細(xì)菌在初篩、復(fù)篩試驗(yàn)中對(duì)MRSA的抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定，表明這些內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生抗MRSA活性物質(zhì)能力是可以穩(wěn)定遺傳的。

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