涼血退赤方含藥血清對人臍靜脈內皮細胞VEGF、bFGF、ANG —1及PEDF表達的影響

祁燕 萬春平 鄭喜 馬珊

摘要：目的研究涼血退赤方（LXTCF）含藥血清對人臍靜脈內皮細胞（ ECV304）血管內皮生長因子（VE（；F）、堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）、促血管生成素1（ANG-1）及色素上皮衍生因子（PEDF）基因及蛋白表達的影響，探討其抑制角膜血管新生的可能作用機制。方法 制備LXTCF含藥血清，以不同濃度的LXTCF含藥血清（10%、20%）作用于ECV304，以正常大鼠血清（10%、20%）處理的ECV304為空白對照組，以單純培養體系處理的ECV304為正常對照組。采用Western Blot.實時熒光定量PCR（RT一PCR）檢測ECV304細胞VEGF、b-FCF、ANC-1及PEDF蛋白及基因表達的變化。結果 與空白對照組（ 20%）[（0.695±0.028），（1.28±0.08）]比較，20% LXTCF含藥血清可明顯降低ECV304細胞VEGF[（0.416±0.053），（0.56 +0. 13）]，b-FGF[（0.306±0.053），（0.64±0.11）]蛋白及基因表達（P<0.05）；含藥血清（10%、20%）對ANC一1及PEDF蛋白及基因表達均無明顯影響（P>0.05）。結論 下調VEGF和b- FCF基因及蛋白表達，從而抑制角膜血管新生，可能是LXTCI治療CRNV性疾病的機制之一。

關鍵詞：涼血退赤方；角膜新生血管；人臍靜脈內皮細胞；血管內皮生長因子、人堿性成纖維生長因子、促血管生成素-1.色素上皮衍生因子

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0061 - 04正常的角膜組織透明，是屈光介質之一。炎癥失調、角膜移植排斥反應、堿灼傷、角膜潰瘍、角膜干細胞缺失等呵引起角膜新生血管（ corneal neovascularization，CRNV）發生[1]。CRNV破壞了角膜的正常微環境，使眼前節相關免疫赦免偏離消失[2]，并導致持續性炎癥和組織瘢痕化，產牛角膜混濁最終導致失明，因此，對CRNV發病機制和治療方法的研究，一直是眼科領域的熱點和難點。內皮細胞（ EC）在NV發生、形成過程中發揮著重要的作用[1]。本實驗選用人臍靜脈內皮細胞株（ ECV304）作為體外研究對象，從“熱郁肝肺”認識CRNV，以“清肝肺郁熱，涼血退赤”立論，探討涼血退赤方（Li-ang Xue Tui Chi formula，LXTCF）抑制CRNV生成的作用及機制，為臨床CRNV性疾病的治療提供理論依據和治療途徑。1 材料與方法1.1 藥物LXTCF藥材組成為臨床常用清熱涼血藥物密蒙花、生蒲黃、木賊、水牛角、海螵蛸等。藥物由云南中醫學院第一附屬醫院中藥房提供，并經云南中醫學院中藥鑒定教研室鑒定。1.2 細胞人臍靜脈血管內皮細胞（ HUVEC）株ECV304，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。1.3 主要試劑RPMI-1640培養基購自CibcoBRL公司；胎牛血清購自Hyclone；RIPA蛋白提取試劑盒購白碧云天；總RNA提取試劑盒購自天根；逆轉錄試劑盒及SYBR Premix ExTaqⅡ均購自于TaKaRa；一抗兔抗大鼠抗體（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）購自博爾森公司；二抗羊抗兔IRDye 800cw購自Li - Cor；內參GADPH購自cell signaling公司；引物（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）均由大連寶生物工程有限公司合成。1.4主要儀器恒溫C02細胞培養箱（Trermo公司，型號：3111）；紅外熒光成像掃描系統（Gene公司，型號：OdysseyCLX）；ABI PCR儀（Gene公司，型號：Veriti）；安捷倫核酸擴增熒光檢測儀（Gene公司，型號：MX3000P）。1.5方法1.5.1 含藥血清的制備采用SPF級SD大鼠20只隨機分為空白對照組與含藥血清組。灌胃給藥，每日早晚各1次，連續3d，給藥組給藥劑量為2 mU200 g（人臨床等效劑量的10倍，相當于原生藥的13.7 g/kg·d），空白對照組給予等容的蒸餾水。末次給藥后lh腹主動脈取血，靜置30min，3000轉離心20min，取上清，56℃滅活30 min，0.22μm的針頭濾器過濾滅菌，置于- 80℃冰箱保存備用。1.5.2

Western Blot檢測含藥血清對ECV304細胞VECF、PEDF、bFGF、ANG -1蛋白表達的影響ECV304以l×I06個/mL接種于6孔板。培養至細胞貼壁80010時，棄舊的培養基，給藥組分別加入體積分數為10%、20%的含藥血清的培養液，空白對照組加入10%、20%正常大鼠血清培養液。正常對照組加入等量培養液（10%胎牛血清），每組5個復孔，繼續培養24h后，提取細胞蛋白，BCA蛋白定量法定量，變性后，以lO%SDS - PAGE電泳分離，轉膜，加入對應抗體孵育后，上紅外熒光成像掃描系統檢測熒光強度。以目的蛋白與GADPH的密度比值作為目的蛋白的相對含量。1.5.3RT - PCR檢測含藥血清對ECV304細胞VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因表達的影響 細胞分組給藥同前，細胞培養完后，取出六孔板，吸去上清液，加預冷的PBS洗1次，加入ImL trizol提取試劑提取細胞總RNA，cDNA合成按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書操作，采用SYBR Greenl嵌合熒光法于熒光定量PCR儀中進行擴增，GADPH為內參對照。結果采用相對定量法：各處理組相對于正常對照組的目的基因的量= 2-△△Ct。在PCR反應程序結束后，進入儀器自帶軟件的數據分析界面，設置CADPH為內參基因（nomalize），正常對照組樣本為對照樣本（ calibrator），儀器自動計算出各實驗組基因表達差異倍數及標準差，即2-△△Ct±標準差值。根據基因庫中基因序列設計VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因及內參基因GADPH引物，各基因引物序列見表1。1.6統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD一t檢驗。2結果2.1 含藥血清對ECV304 VEGF、bFGF、ANC -1、PEDF蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，20%含藥血清作用24h后，與20%空白對照組比較ECV304 VEGF及bFGF蛋白表達明顯降低（P<0.05）；各濃度（ 10%，20%）含藥血清對ANG -l、PEDF蛋白表達均無明顯影響（P>0.05），見表2、圖1。2.2 含藥血清對ECV304細胞VEGFmRNA、bFCF mRNA、AN（； -l mRNA、PF DF mRNA表達的影響 檢測所提取樣本總RNA A260/A280在1.8～2.0之間，RNA較純，無蛋白質污染，內參及目的基因標準曲線相關系數大于0. 99，擴增效率90%～ 120%之間，可用2-△△Ct計算基因相對表達量。內參及目的基因溶解曲線峰形單一，擴增產物特異性較好。實驗結果表叫，含藥血清作用于細胞24h后，與20%空白大鼠血清對照組比較，ECV304細胞VEGF mRNA表達明顯降低（P<0.05）；各濃度含藥血清作用于細胞24h后，對ECV304胞內ANG-1mRNA、PEDF mRNA表達均無明顯影響（P>0.05）3討論

目前認為角膜新生血管的發生與促血管形成因子和抗血管形成因子的平衡失調有關。生理狀態下，角膜拈抗血管形成因子和促血管形成因子共同表達，維持平衡。許多研究表明，血管生成刺激因子如血管內皮生長因子與血管生成抑制因子如色素上皮衍生因子之間平衡的破壞是導致新生血管發生的主要原因[3]。血管內皮因子（VEGF）是主要的促血管生成因子[4]，抑制VEGF的表達即可抑制新生血管的形成[5]；VEGF、的表達與CNV的形成成正相關，VEGF可刺激血管內皮細胞增殖，進而促進新生血管的形成[6]。bFGF是血管新生的主要誘導因子且和VEGF有協同作用，甚至有報道bFGF促進脈絡膜毛細血管細胞增殖作用強于VFGF[7]，血管生成索1（Ang -1）也是特異作用于新生血管發生的主要細胞內皮細胞的一類促新生血管細胞岡子。其可拮抗血管內皮細胞凋亡，促進培養內皮細胞遷移和形成管狀結構，維持內皮細胞的靜息狀態和血管的完整。還可加強VEGF和內皮細胞生長因子（ EGF）促血管網存活的作用。當以上機制發乍住視網膜或者脈絡膜，就起到了促使CRNV形成的過程[8]。色素上皮衍生因子（ PEDF）具有抑制血管生成的功能。在體外實驗中，PEDF能抑制內皮細胞的遷移，能使bFGF誘導的毛細血管減少40%，被認為是最有效的天然的血管生成抑制劑，PEDF在晚期CRNV的RPE細胞中有高度上調的表達，抑制CRNV的發展[9]。

“角膜”在中醫眼科學中稱為黑睛，屬于五輪中風輪，內應肝膽，黑睛疾病治則祛風清熱、退翳明日。本課題從“熱郁肝肺”認識CRNV以“清肝肺郁熱，涼血退赤”立淪治療CRNV，希望能挖掘出中醫藥治療CRNV類疾病的巨大優勢潛力.

本課題前期研究結果表明[10]，20%涼血退赤方含藥血消可顯著降低人臍靜脈內皮細胞ECV304細胞培養上清中VEGF含量。本研究進一步在人臍靜脈內皮細胞模型上，研究涼血退赤方對促血管形成因子（VECF、bFGF和Ang-1）和角膜拮抗血管形成因子（ PEDF）的調控作用，揭示涼血退赤方抑制新生血管形成的分子機制。實驗結果顯示，20%含藥血清可降低ECV304細胞VEGF及bFGF基因及蛋白表達，但對ANG -1及PEDF表達無明顯影響。以L研究結果提示，涼血退赤方可能通過下調促血管形成岡子VEGF及b-FGF的表達，進而抑制角膜新生血管的形成。但本研究只觀察了含藥血清對正常培養狀態下細胞VECF等指標的影響，而在刺激或有損傷岡素作用下含藥血清對ANC -1、PEDF等岡子表達的是否有影響，及其相關的調控機制、信號傳導途徑，仍有待于進一步的研究。參考文獻：[1] Penn JS，Madan A，Caldwell RB，et al.Vascular endothelial growth factor in eye disease[Jl. Prog Retin Eye Res，2008.27（4）：331 – 371[2] Dana MR，Streilein JW.Loss and restoralion of immune privilegein eyeswith corneal neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sei， 1996，37.2485 - 2494.[3] Miller JW. Vascular endothelial growth factor and ocularneovascularization[J]. Am J Pathol，1997 ，151（1）：13 - 23.[4]劉志剛，陳芳育，蔣立輝，等.血管抑素下調舌鱗癌細胞血管內皮生長因子的表達[J].第三軍醫大學學報，2008，30（16）：1557 - 1560.[5]劉子彬，劉海俊，許丹丹，等.血管抑索對內皮細胞VEGF表達的影響[J].中國美容醫學，2012，21（7）：1165 -1167[6]丁怡，張明昌.CD105和血管內皮生長因子在大鼠角膜新生血管中的表達[J].華中科技大學學報，2010 ，39 （2） ：221-224.[7] Zubilewicz A，Hecquet C，Jeanny J，et al. Find all citations hy this au-thor（ default）. Orfilter your current searchFind all citations by this au-thor（ default）. Orfilter your current searchTwo distinct signalling path-ways are involved in FCF2 - stimulated proliferation of choriocapillaryendothelial cells ：a comparative study with VEGF-[J] . Oncogene，2001 ，20 （ 12 ） ：1403 - 1413.[8]王應利，惠延年，血管生成素1對視網膜新生血管形成的作用及其機制[J].中華眼底病雜志，2007，3（23）：149-152.[9]汪浩，王文吉.脈絡膜新生血管的治療進展[J].國外醫學眼科分冊，2001：25：288 - 295.[10]馬珊，馬俊，彭華，等，涼血活血中藥含藥血清對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響[J].昆明醫科大學學報，2012，11（33）：38 -41.（收稿日期：2014-09-21）