IME-FICC 法聯合流式細胞儀檢測膀胱癌患者外周血微轉移的臨床意義

江偉凡，熊建華

（南昌大學第二附屬醫院泌尿外科，南昌 330006）

膀胱癌是泌尿系統惡性腫瘤中最為常見的一種，90%以上的患者病情屬于膀胱移行細胞癌，且20%左右為浸潤癌。浸潤癌患者的復發率及轉移率相對較高，實際生存率較低，即使通過化療、放療、手術等方法對原發腫瘤與實體轉移灶進行治療，存在淋巴結轉移或遠處轉移者在5年內的生存率也僅僅能夠達到5%左右。如何早期發現和診斷膀胱癌是否發生轉移是目前迫切需要解決的難題。本研究應用免疫磁珠陰性富集技術結合免疫熒光細胞化學技術（IME-FICC）檢測膀胱癌患者外周血循環腫瘤細胞，聯合應用多參數流式細胞儀方法（FCM）檢測膀胱癌患者外周血CD105、CD146，探索一種早期發現膀胱癌患者外周血微轉移的方法。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2014年6月南昌大學第二附屬醫院泌尿外科經病理檢查證實的膀胱癌患者60例作為研究組，健康志愿者15例作為對照組。所有研究對象抽血前均沒有化療、放療及免疫等治療史，沒有其他系統惡性腫瘤病史或同時合并其他系統惡性腫瘤病史。按各自設定標準分別納入研究對象。研究組中男46例，女14例；年齡35～77歲，平均年齡51歲；對照組中男9例，女6例；年齡34～52歲，平均年齡41歲。所有研究對象簽署知情同意書、并經院倫理委員會討論通過。

1.2 研究方法

所有研究對象在入院后，晨起空腹狀態下，采集7.5mL靜脈血于抗凝管中。留取血液標本200μL，通過FCM檢測方式測定外周血CD105、CD146水平。剩余的血液標本采用IME-FICC檢測外周血循環腫瘤細胞（CTC）。

1.2.1 IME-FICC檢測

采集的血液應在48h內完成CD45免疫磁珠陰性富集。

1）細胞分離：①去除血漿蛋白及脂類：將標本轉至干燥的50mL離心管，離心后可見明顯分層，用電動負壓吸引器吸去上層清夜，保留含沉淀及余液7.5mL；②溶解紅細胞：依次加AS2及AS3液，離心2次后取上清液，保留余液（含白色沉淀）約5mL；③洗滌細胞：再次加AS1液，離心后保留余液（含白色沉淀）約1mL。

2）去除白細胞：取表面結合抗白細胞抗原（CD45）的抗體的磁珠顆粒進行陰性富集。

3）細胞固定：將混勻的含細胞液加至已經包被玻片的中央環加樣區，溫室靜置1～2h，用記號筆標記細胞區，待玻片干燥后進行染色或置于玻片盒-80℃保存。

1.2.2 細胞化學染色

1）打孔：將干燥玻片置于TBS液中5min，再將玻片置于0.1%TritonX-100中5min，目的是增加細胞通透性。2）抗原固定：將玻片用PBS清洗3次。然后浸浴于2%多聚甲醛中40min，目的是固定抗原，之后用TBS清洗3次，洗畢用濾紙吸去多余水分。3）抗體孵育：暗室中，在玻片上滴加抗CD45抗體／抗CK20／0.2%BSA熒光抗體。4）清洗：分別用0.2%BSA和TBS清洗3次。5）顯色：在細胞區內加入7μL熒光計數液（含DAPI），最后加蓋玻片固定封片，之后即可在顯微鏡下計數或4℃保存（時間不超過3d）。

1.2.3 CTC的判定標準及陽性意義

1）形態學：①細胞呈圓形、橢圓形或長型，細胞長徑大于10μm；②熒光下細胞形態及邊緣完整；③光鏡下可見完整細胞形態及細胞核。2）免疫熒光陽性標準：CK20+、CD45-、DAPI+。結果判定：由兩位經培訓實驗員在熒光顯微鏡下分別觀察細胞顯色情況，按照以上標準采集陽性細胞圖像、計數。3）陽性界定值：本課題以見到CTC，即≥1為陽性結果。

1.2.4 FCM檢測

1）取血液標本200μL，各加入實驗組和對照組流式管內100μL，CD45、CD105及CD146抗體標記，設同型對照組。2）破紅細胞膜依次加入破紅液A液600μL，及破紅液B液200μL，離心后，去上清液，剩余為有核細胞，加PBS緩沖液500μL，震蕩2s，使細胞混勻，待上機檢測。3）流式細胞儀測定：采用CD45設門方法獲取105個細胞，以CD45-CD105+CD146+細胞為陽性細胞，計數陽性細胞的數目，判定結果。凡≥8判定為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行分析。計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

研究組患者的外周血CK20、CD105／CD146陽性率均明顯高于對照組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 2組外周血CK20、CD105／CD146陽性率比較

3 討論

原發腫瘤發生脫離之后進入到患者機體循環系統的腫瘤細胞是實體腫瘤在遠處部位發生轉移的一個必要條件[1]。血液循環系統中存在的腫瘤細胞具有與原發瘤細胞相同的細胞學和基因遺傳學特征[2]。從患者外周血經過分離后得到的循環腫瘤細胞接種到試驗小鼠機體之后可以在接種的部位和遠隔器官產生轉移病灶，證明循環腫瘤細胞具有較強的轉移潛能[3]。

如何早期發現和診斷腫瘤是否發生轉移是目前迫切需要解決的難題。近年來臨床上相關的腫瘤免疫學、腫瘤生物化學、酶學及腫瘤分子生物學研究結果充分提示上皮性惡性腫瘤在侵襲和轉移發生的早期階段就可能有癌細胞進入血液循環中形成循環腫瘤細胞（CTC），即微轉移。因此如何準確發現腫瘤微轉移成為當前的研究熱點之一。

在人體血液中存在的大量各類血細胞相比較，脫落至外周血液中的腫瘤細胞數目相對稀少，形態表現各異，分離、富集、鑒定難度較大。隨著近年來免疫磁珠、多色熒光標記、流式細胞儀等技術的發展，使得分離、富集血液中的腫瘤細胞成為可能[4]。免疫磁珠分離技術（Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS）是研究較多的新型免疫學技術的一種[5]。磁珠的富集方法可以分為正性富集和負性富集兩種類型，且各有優劣[6]。本次研究中主要采用負性富集方式進行，其基本原理是將患者血液中其他細胞除去，剩余細胞即為包含CTC在內的全部稀有細胞，再對其實施鑒定。應用負性富集方法富集的CTC不會受腫瘤細胞表達上皮抗原量多少產生的影響，只需將外周血中大部分白細胞去除。

外周血進行富集之后的鑒定CTC的步驟是本課題的重要環節。臨床上對實體瘤CTC進行鑒定的方法總體而言可以分為檢測核酸和細胞形態學辨別兩種。前者是對在腫瘤細胞和血液成分中差異表達的DNA或RNA情況進行檢測；后者主要是采用細胞形態染色法或免疫細胞化學法對腫瘤細胞進行鑒定。本次研究中采用的是免疫熒光結合細胞形態的方法對CTC進行鑒定，具體的評判標準為：CK20染色顯示為陽性，CD45染色顯示為陰性；細胞核DAPI顯示為陽性。

CK20是細胞角蛋白的一種，具有嚴格的上皮組織特異性，CK20在上皮源性的腫瘤中存在明顯的表達，而外周血、骨髓、淋巴組織中沒有任何表達。表達具有較高組織特異性，CK20是對腫瘤疾病進行診斷的一個有價值的指標。已經播散到血液循環中的惡性腫瘤細胞仍然能夠繼續表達原組織細胞的特異性，故通過對外周血CK20表達情況進行測定，即可對血液循環中膀胱腫瘤細胞的存在情況有充分的了解，對膀胱癌微轉移的判斷具有一定的幫助作用。

CD105對血管生成期間小血管內皮細胞染色的敏感性較高，在腫瘤組織增殖狀態較為活躍的內皮細胞中呈現高表達，但在大多數正常組織中沒有任何表達[7]。有研究[8]發現，直腸癌、乳腺癌等實性腫瘤發生轉移的患者血清S-CD105的表達水平顯著高于未發生轉移的患者，從而提出血清S-CD105作為血管生成的標志，可以用來預測惡性腫瘤患者疾病復發、轉移的危險性。所以CD105高表達可以作為對惡性腫瘤病灶轉移和預后情況進行判斷的一個重要指標。

CD146是Ca2+非依賴性細胞黏附分子的膜糖蛋白類物質的一種，屬于免疫球蛋白超家族中的一個主要成員，對細胞與細胞之間或細胞與細胞外基質之間的相互作用進行介導，對局部黏連聚集、細胞骨架重組、細胞間相互作用、細胞形態的維持及細胞游走和增殖的調控具有一定的幫助作用。目前臨床觀點認為腫瘤發生轉移需要腫瘤細胞能夠順利進出血管系統，腫瘤中CD146陽性血管內皮可以與腫瘤細胞上存在的CD146受體發生結合反應，從而參與到腫瘤細胞進出血管系統的過程中。另外由CD146介導形成的腫瘤細胞簇對腫瘤細胞間的作用和腫瘤細胞的生長可以產生一定的幫助[9]。有研究[10]結果表明CD146對內皮細胞的黏附、增殖、遷移過程具有促進作用，充分提示其在血管新生過程中起重要作用。

本課題在已有的研究基礎上，結合國內外關于腫瘤微轉移最新研究進展，應用IME-FICC檢測膀胱癌患者外周血循環腫瘤細胞，聯合FCM檢測膀胱癌患者外周血血管內皮細胞的特異性標志物CD105、CD146具有較高的敏感性。為膀胱癌微轉移的早期診斷提供新的思路和理論依據。

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