我國高血壓病的流行與控制狀況研究進展

王增武

[摘要]目的觀察β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達，探討其在膿毒癥心肌損傷中的作用。方法采用腹腔注射大腸桿菌內毒素（LPS）制作膿毒癥模型，在相對應的時間點采用左心室插管術測量心功能參數，留取心臟組織分別用免疫印跡（Western Blot）、免疫組化（IHC）檢測β3整合素的表達以及HE染色、天狼猩紅染色觀察心肌組織形態學變化。結果心功能參數的改變主要發生在膿毒癥早期，即左心室舒張壓、左心室發展壓、左心室壓力上升的最大變化速率、左心室壓力下降的最大變化速率、心肌耗氧指數與對照組相比較，差異有統計學意義（P<005），組織形態學觀察實驗組大鼠心肌組織細胞空泡變性，排列松散，結構紊亂，間質膠原纖維數量減少。Western Blot和IHC結果顯示實驗組β3整合素與對照組比較降低，且6h后較顯著，差異有統計學意義（P<001）。結論在膿毒癥心肌損傷的過程中，β3整合素表達改變顯著，其可能參與了膿毒癥心肌損傷的機制。

[關鍵詞]膿毒癥；心肌損傷；β3整合素

中圖分類號：R631文獻標識碼：A文章編號：1009_816X（2015）04_0274_04

doi：103969/jissn1009_816x20150403Study of the Effects of β3 Integrin in Sepsis Induced Myocardial Injury in Rats. LU Yun_yan， YAN Jing. First People's Hospital of Xiaoshan， Zhejiang 311200， China

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes of changes of expression changes of expressionβ3 integrin in septic rat hearts and its roles in sepsis induced myocardial injury. Methods Sprague_Dawle rats in experimental group were injected Escherichia coli endotoxin （LPS）. At the corresponding time of points， the hearts were isolated for morphologic pathology and sirius red staining， and cardiac functions， including left ventricular developed pressure （LVDP）， left ventricular pressure maximal rate of rise （+dP/dtmax）， left ventricular pressure the maximum rate of descent （-dP/dtmax）， myocardial oxygen consumption index （SPTI*HR） and left ventricular end diastolic pressure （LVEDP） were measured using left ventricular catheterization. The expression of β3 integrin in myocardium were measured using western blotting and immunohistochemistry. Results Hemodynamic changes occurred in the early stage of sepsis. LVDP， +dP/dtmax， -dP/dtmax， SPTI*HR in experimental group decreased significantly， compared with those in control group （P<0.05）. Histopathology of the hearts in LPS group showed vacuolar degeneration， arrangement in loose， structural disorder， interstitial collagen fibers decreased. Western Blot and IHC showed that β3 integrin expression decreased in experimental group， especially 6h after LPS injection（P<0.01）. Conclusions There were significant structural and functional changes in sepsis_induced myocardial injury and β3 integrin involved in the mechanisms of myocardial injury in sepsis rats.

[Key words] Sepsis； Myocardial injury； Beta3 integrin

膿毒癥（Sepsis）是目前ICU中的首要死亡原因。40%～50%膿毒癥患者合并心功能不全，研究表明膿毒癥患者伴心功能不全死亡率（70%）與不伴心功能不全（20%）比較明顯升高[1]。整合素是由α和β亞基通過非共價鍵組成的異二聚體，廣泛分布于細胞表面，是細胞表面一類重要的兼具粘附和信號傳導功能的受體[2]。其參與了正常心臟發育和某些心臟疾病如心肌肥厚、擴張性心肌病和心肌梗死等的發生過程[3]，但其是否參與膿毒癥心肌損傷的機制尚不清楚。本研究觀察膿毒癥大鼠心肌組織β3整合素表達與膿毒癥大鼠心功能參數的變化，探討膿毒癥導致心肌損傷的相關機制。

1材料與方法

11實驗動物：選用8至10周、清潔級、雄性SD大鼠90只，體重200～250g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供（2011年10月）。室溫飼養，自由飲食，適應性飼養1周后開始實驗。按照隨機分配原則分成9組。（1）實驗組（LPS組）：采用腹腔注射大腸桿菌內毒素（LPS）5mg/kg制作膿毒癥模型，其中實驗組按LPS作用時間分成8個亞組：1小時組（LPS 1h），2小時組（LPS 2h），4小時組（LPS 4h），6小時組（LPS 6h），12小時組（LPS 12h），18小時組（LPS 18h），24小時組（LPS 24h），48小時組（LPS 48h），各組均為10只。（2）對照組（NS組）：腹腔注射09%氯化鈉注射液（5ml/kg），共10只。

12實驗方法：

121心功能參數測定：采用改良的左心室插管術[4]檢測大鼠心功能參數。實驗組和對照組大鼠以腹腔注射10%烏拉坦（10ml/kg）麻醉并固定，頸部正中切口，分離出右頸總動脈，動脈導管沿右頸總動脈在壓力波形的指導下插入左心室，測量左心室舒張壓（LVEDP）、左心室發展壓（LVDP）、左心室壓力上升的最大變化速率（+dP/dtmax）、左心室壓力下降的最大變化速率（-dP/dtmax）、心肌耗氧指數（SPTI*HR）等指標。采用上海奧爾科特生物科技有限公司MPA心功能分析系統記錄和分析。

122心臟樣本采集：所有大鼠在心功能監測完畢后，常規消毒，腹正中切開，鈍性分離，摘取心臟，取小部分新鮮的心肌組織置于液氮中保存用于Western Blot測定，余下的置于10%甲醛溶液中固定做HE染色及免疫組織化學（IHC）檢測。

123HE染色：光鏡觀察大鼠心肌組織的病理形態。各組心肌組織塊置入10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木素染色、封片。

124苦味酸天狼猩紅染色：切片脫蠟、蒸餾水洗、苦味酸天狼紅染液染30～60min、無水酒精直接分化與脫水、二甲苯透明，封片。

125免疫印跡（Western Blot）檢測心肌組織中β3整合素：用液氮研磨新鮮的大鼠心肌組織，加入裂解液，在冰上孵育半小時后4℃離心機后提取上清液為蛋白液，采用BCA法測定蛋白水平。根據樣品水平，吸取20ug蛋白上樣（稀釋成20ul），用6%SDS_PACE（SDS變性不連續聚丙烯酰胺）凝膠電泳，取出凝膠進行濕轉膜（100V 15h），把蛋白質轉移到PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，經過封閉、清洗，加一抗（1：1500）4℃過夜孵育，沖洗，辣根過氧化物酶標記二抗孵育，用化學發光儀顯影。

126免疫組化（IHC）檢測心肌組織中β3整合素：將石蠟脫水化和抗原熱修復，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，一抗4℃過夜孵育，沖洗，辣根過氧化物酶標記二抗孵育（37℃，05h），以二氨基聯苯胺（DAB）顯色、蘇木素襯染，然后常規脫水、透明、封片、鏡檢觀察結果，呈棕黃色者判為陽性。

13統計學處理：采用SPSS170統計學軟件處理，數據結果以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用t檢驗，P<005為差異有統計學意義。

2結果

21心功能變化：實驗組與對照組比較，實驗組大鼠的LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmax、SPTI*HR較對照組（NS組）顯著降低，其中1h、2h、4h、6h下降明顯；而LVEDP則明顯升高，差異有統計學意義（P<005），見表1。表1心功能參數變化（x-±s）

組別（n=10）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dP/dtmax（mmHg/s）-dP/dtmax（mmHg/s）SPTI*HR（mmHg*s*bpm）對照組NS16184±2803-1541±382615848±45133-567138±70265402537±49964實驗組LPS_1h11707±1392*-231±539*418442±34945*-361402±46023*313105±25610*LPS_2h11273±1115*-061±165*396177±34445*-330171±42415*270522±93201*LPS_4h12448±1578*-2019±622516089±43715*-456751±120371232879±55680*LPS_6h12832±1826*-1465±662518572±33696*-509908±73444290733±43647*LPS_12h17019±2031-2037±318654288±26910〖〗-610782±71625364788±15801LPS_18h17689±508-1931±090721011±15247*-627860±23558252362±39016*LPS_24h15822±3537-1367±360619572±23410〖〗-613823±11855307237±57040*LPS_48h14405±2930-981±324565045±23410-493864±116074399480±73360P<001<001<001<001<001F5542004595369573注：與對照組比較P<00522光鏡下觀察大鼠心肌組織形態學變化：

221HE染色觀察心肌組織病理形態學的變化：對照組大鼠心肌組織光鏡下可見心肌細胞為短柱狀的肌纖維，胞核較粗大，肌纖維呈束狀分布；間質纖維細胞呈梭形，分布在心肌束的外緣或突向心肌間質，胞核細長。實驗組，LPS 6h時未見明顯的形態變化，偶見輕度水腫及炎癥細胞浸潤，LPS 12h后可見心肌細胞腫脹、灶性心肌纖維斷裂，心肌細胞可見空泡變性、心肌細胞排列松散，結構紊亂，見圖1。圖1大鼠心肌組織病理學觀察（HE，×400）

222苦味酸天狼猩紅染色觀察心肌間質纖維組織的變化：對照組大鼠心肌組織經苦味酸天狼猩紅染色，普通光鏡下心肌肌纖維呈淡黃色，心肌間質的膠原纖維呈猩紅色。對照組心肌組織光鏡下可見猩紅色膠原纖維包圍在心肌實質細胞周圍排列較整齊。實驗組猩紅色膠原纖維與對照組相比排列紊亂，其膠原纖維在心肌實質細胞周圍的數量明顯減少，見圖2。圖2大鼠心肌組織病理學觀察（天狼猩紅染色，×200）

23β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達變化：

231Western Blot檢測β3整合素蛋白表達：β3整合素實驗組與對照組比較蛋白條帶顏色變淡，說明其表達降低（實驗中均以β_actin為內參作為對照），且在LPS 6h、LPS 12h、LPS 18h、LPS 24h、LPS 48h實驗組條帶顏色明顯變淡，說明其表達顯著下降，見圖3。

圖3Western Blot檢測大鼠心肌組織β3整合素蛋白條帶

232免疫組化檢測大鼠心肌組織中β3整合素表達：以對照組（NS組）加PBS做陰性對照（NS_PBS），觀察結果：β3整合素的表達主要在心肌實質細胞，與陰性對照相比其陽性表現是細胞胞漿染色呈均質淡棕黃色。實驗組與對照組相比較其胞漿棕黃色顏色明顯變淺，說明在β3整合素在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達降低，見圖4。圖4大鼠心肌組織β3整合素表達（×200）3討論

本研究應用大鼠腹腔注射LPS的方法制作膿毒癥動物模型，分別在不同的作用時間點監測大鼠心臟功能及組織結構的改變以及心肌組織中β3整合素的變化，結果發現在膿毒癥發生早期大鼠即發生心功能的變化，而心臟組織結構形態的變化則出現較晚，通過Western blot及IHC發現心肌組織中β3整合素的改變主要發生在LPS注射6h之后的實驗組，說明β3整合素的改變與心臟組織結構的變化存在密切關系。

目前膿毒癥心肌損傷的機制尚不明確，認為主要包括以下幾個方面：細胞因子對心肌的損傷（TNF_α、IL_1β、IL_6）；一氧化氮的影響；缺血-再灌注和氧自由基損傷；心肌細胞內Ca2+穩態失衡；能量代謝異常；心肌局部腎素-血管緊張素RAS系統的過度激活等，而近年來心肌凋亡途徑參與膿毒癥心肌損傷的機制也受到重視[5]。

本文應用Western blot和免疫組化檢測膿毒癥大鼠心肌組織中β3整合素的表達變化，結果顯示心肌組織中β3整合素在LPS作用6h后與對照組相比較表現為顯著性的下降（灰度值比較P<001），推測β3整合素在膿毒癥心肌損傷中發生了顯著改變，分析其可能與心肌細胞內Ca2+穩態顯著性改變、細胞凋亡、血小板活化等因素相關。

心肌細胞內Ca2+穩態顯著性改變是膿毒癥心肌損傷的重要機制之一，研究表明細胞內Ca2+超載在心肌缺血-再灌注損傷發病機制中起中心作用[6]。整合素受體中的αIIbβ3、αvβ6、αvβ5、α5β1 及α5β3都曾被發現與Ca2+電流信號有關，它們可以介導細胞與纖維連接蛋白之間的連接，短暫激活p42/p44 MARK通路，增加心肌細胞內的鈣離子濃度[7]。此外有研究發現用β3整合素基因敲除的老鼠中研究證明β3整合素介導Pyk2途徑在導致心臟纖維化中起到關鍵作用[8]。在本研究膿毒癥心肌損傷中，整合素受體與鈣離子濃度相關的β3整合素的表達異常，說明其可能參與心肌細胞內鈣離子濃度失衡機制，使心肌收縮和舒張功能受到抑制，最終導致心力衰竭。

在膿毒癥心肌損傷的機制中兩條細胞凋亡途徑已經被確認：第一是腫瘤壞死因子受體（TRADD）相關激活第一途徑（外源性凋亡級聯）；第二個途徑由外源應力引起的刺激激活的凋亡機制。在多種動物模型中觀察到αvβ3抑制劑可通過激活半胱天冬酶8（Caspase 8）依賴凋亡通路及增強腫瘤抑制因子p56活性、降低抗凋亡蛋白Bax水平，誘導內皮細胞發生凋亡，從而抑制血管、腫瘤生長[9]。在本研究中發現β3整合素在膿毒癥晚期表達顯著性下降，分析其可能促使細胞凋亡機制紊亂，激活相關凋亡途徑，使心肌病理凋亡過程加速，從而導致膿毒癥心肌損傷后心力衰竭的發生。

另外，整合素αIIbβ3主要表達于巨核細胞和血小板表面，是血小板膜的主要受體，并且它的活化被視作血小板活化及血栓形成的最終共同通路。當整合素αIIbβ3表達異常或缺陷時，可能導致心肌組織間的瘀血現象，進一步造成心肌組織病理形態學和功能學的改變[10]。最近研究發現心肌組織中β3整合素缺失會增加毛細血管通透性和組織液的滲漏，導致心肌組織的損傷[11]。

本文表明膿毒癥大鼠心肌組織中β3整合素表達顯著性下降，但其具體機制需進一步研究。

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（收稿日期：2015_3_10）