電針“內關”“心俞”對急性心肌梗死大鼠心肌組織MMP-2、TIMP-2表達的影響

杜慧靜，陳 峰，唐關敏，徐文博

（1.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053； 2.嘉興市第一醫院心內科，浙江 嘉興310053；3.嘉興市第一醫院中醫針灸科，浙江嘉興310053）

急性心肌梗死（AMI）是缺血性心臟病中死亡和致殘的主要原因［1-2］。介入是治療AMI最有效的方法，但受梗死面積及再灌注時間的限制并可能引起進一步的心肌損傷，缺血缺氧一旦發生，會導致心肌壞死，繼發心律失常、心室重構等。目前已經證實針刺在臨床上治療心律失常為行之有效的手段［3］，且近年來的研究發現針刺對缺血性疾病有調節作用。本研究旨在通過研究針刺對基質金屬蛋白酶（MMP-2）、組織基質金屬蛋白酶-2（TIMP-2）的調節作用探討電針對AMI的療效及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級 SD 雄性大鼠 32只，體重（270±20）g，由江蘇大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（蘇）2013-0011。適應性飼養5 d后開始實驗，隨機分為正常組8只，余16只大鼠復制AMI模型，模型復制成功后隨機分為模型組和電針組各8只。

1.2 儀器與試劑

小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），LH202H型韓氏穴位神經刺激儀（北京華衛有限公司生產），生物系統信號采集儀（淮北正華生物儀器設備有限公司），正置顯微鏡［OLYMPUS（CX41）公司］，恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司），石蠟切片機（徠克公司）。牛血清蛋白（BSA）（北京索萊寶生物科技有限公司），DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術有限公司），中性樹脂（上海長島生物技術有限公司），二抗（上海長島生物技術有限公司），引物及探針（TAKARA公司），熒光定量PCR儀（Applied Biosystem），FTC3000HT（Funglyn Biotech Incorporated）。

1.3 造模及針刺方法

采用冠狀動脈前降支結扎法復制大鼠AMI模型。4%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，四肢固定，經口氣管盲插，連接小動物呼吸機輔助通氣，呼吸頻率 70 次/min，潮氣量 2～3 mL，呼吸比為 1∶2。肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1.0～2.0 mm處用6/0線結扎冠狀動脈前降支，結扎后可見左室前壁失去原有光澤，色變蒼白，并出現搏動減弱，心電監測可見肢體導聯R波振幅明顯升高，ST段抬高，證實AMI模型制備成功。術后注射青霉素預防感染。電針組取大鼠雙側“內關”“心俞”，穴位參照《實驗針灸學》介紹方法選取；用30號半寸毫針垂直刺入2.0～3.0 mm，連接韓氏穴位神經刺激儀，頻率2 Hz/100 Hz等幅疏密波，電流強度1 mA，以肢體出現輕微抽動為度。每天1次，連續5 d。正常組和模型組不進行針刺。

1.4 觀察指標及檢測方法

心電圖檢測：將大鼠以4%水合氯醛腹腔注射麻醉固定，將針電極插入四肢皮下作為肢導聯的電極，連接生物系統信號采集儀觀察記錄標準肢體Ⅱ導心電圖，記錄各組心電圖。

免疫組化：免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。在OLYMPUS光學顯微鏡下200倍放大拍照，每張切片在近梗死區隨機觀察5個視野，分析陽性表達面積。

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）：取心肌組織，用Trizol法提取RNA，檢測RNA純度及濃度，取純度好的樣品進行逆轉錄反應，12.5 μL反應體系，cDNA置-20℃保存備用。RT-PCR反應體系為25 μL，ddH2O：10.5 μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）：12.5 μL，PCR-F（10 μM）：0.5 μL，PCR-R（10 μM）：0.5 μL，模板 cDNA：1.0 μL，反應條件：95 ℃，1 min；40 個循環：95 ℃，10 s；64 ℃，25 s（收集熒光）；熔點曲線分析55℃to 95℃。每個樣本進行3個重復，與正常組進行相對定量分析比較，計算mRNA的相對表達量。以RNA18S為內參照，對目標基因進行歸一化處理，比較相同樣品中目標基因的量。采用相對定量法，本實驗結果采用2△Ct法對樣本中的基因表達水平進行比較，測定各組MMP-2、TIMP-2相對于內參基因表達量。RT-PCR引物及相關情況見表1。

表1 Real-Time PCR引物及相關情況

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 心電圖結果

各組心電圖檢查結果見圖1。

圖1 各組心電圖檢測結果

從圖1中可以看出，結扎左冠狀動脈前降支后，大鼠Ⅱ導聯心電圖上出現ST段上抬，T波抬高。電針5 d后大鼠心率基本恢復正常有輕度ST段異常。AMI組5 d后心電圖T波呈現低平狀態。

2.2 Cx43陽性表達面積

N組、AMI組、E組Cx43陽性表達面積分別為957.00±44.50，526.00±4.58，605.00±10.44。模型組Cx43陽性表達面積較正常組明顯下降（P<0.01），電針組的Cx43陽性表達面積與模型組比較有顯著上升趨勢（P<0.01）。

2.3 MMP-2、TIMP-2表達量的變化

模型組MMP-2表達量較正常組稍有上升，但是差異無統計學意義，模型組TIMP-2的表達量較正常組顯著下降（P<0.05）。電針組MMP-2、TIMP-2的表達量與模型組比較均明顯上升（P<0.05）。結果見表2。

表2 各組MMP-2、TIMP-2表達量 （±s）

表2 各組MMP-2、TIMP-2表達量 （±s）

注：與正常組比較，1）P<0.05；與模型組比較，2）P<0.05

組別 n MMP-2 TIMP-2正常組 80.14±0.0324.35±13.09模型組 80.18±0.056.15±4.731）電針組 81.69±0.921） 16.11±4.642）

3 討論

急性心肌梗死典型癥狀為胸骨后或心前區壓榨樣疼痛，故依據其癥狀特點可歸屬于中醫的“胸痹”“真心痛”“厥心痛”。中醫認為其病因與氣虛、血瘀、痰凝、氣滯相關。唐朝孫思邈在《千金要方》和《千金翼方》中指出“心痛暴出，絞急欲絕，灸神府百壯……”，“心痛如椎針刺，然谷、太溪主之”“心痛短氣不足以息，刺手太陰”“胸痹引背時寒，間使主之”。以上論述均為針灸治療的有效經驗。

現代研究表明，心肌梗死后心律失常、心室重構發生等造成一系列損傷。有研究證實，細胞外基質（ECM）的過分降解在心室重構中發揮一定作用，其中MMP在ECM降解中起重要作用，新近研究表明MMP/TIMP之間的平衡在維持組織結構的完整和內環境穩定中起重要作用［4］。MMP-2是MMP家族中的重要成員，主要在心室合成，是一組能特異降解ECM的蛋白水解酶［5］。TIMP是MMP的組織抑制因子，參與調解組織局部MMP的活性［5］。Cx43是心肌和心室肌細胞的主要連接蛋白，也是細胞內的主要電流傳導體，如果功能異常易引起心律失常和心肌沖動傳導異常，其表達量與缺血性心臟病發展進程有關系［6］。

本研究采用電針療法，在針刺腧穴的基礎上，加以脈沖電的治療作用，更能正確地掌握刺激參數，以期對AMI有更好的療效。本實驗結果發現結扎大鼠左冠狀動脈前降支后，大鼠Ⅱ導聯心電圖上出現ST段上抬，T波抬高，而連續電針5 d后急性心肌梗死大鼠心電圖得到改善，ST段下移，心律恢復。模型組梗死心肌周圍Cx43表達下降，但是針刺組Cx43有明顯升高，說明針刺可以保護心肌組織的損傷，調節心律。電針組MMP-2表達升高，TIMP-2表達下降，說明電針可以通過調節MMP-2、TIMP-2的表達保護缺血梗死心肌組織，且有效對抗心律失常。

綜上所述，電針內關、心俞穴可以調節心肌組織微環境相關基因的表達，調節心律失常，保護缺血梗死心肌組織，防止心室重構。

［1］World Health Organization.Guidelines for the treatment of malaria［M］.2ndEdition.Geneva：World Health Organization，2006.

［2］Sadowski M，Janion-Sadowska A，Gasior M，et al.Higher mortality in women after ST-segment elevation myocardial infarction in very young patients［J］.Arch Med Sci，2013，9（3）：427-433.

［3］鐘輝，李國彰.針刺治療心律失常的研究進展［J］.中國醫藥學報，2002，17（增刊）：42-46

［4］Ahmed S H，Clark L L，Pennington W R，et al.Matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of metalloproteinases：relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and structural，functional，and clinical manifestations of hypertensive heart disease［J］.Digest of World Core Medical Journals（Cardiology），2006，113（17）：2089-2096.

［5］Biolo A，Fisch M，Balog J，et al.Episodes of acute heart failure syndrome are associated with increased levels of troponin and extracellular matrix markers［J］.Circ Heart Fail，2010，3（1）：44-50.

［6］Lerner D L，Yamada K A，Schuessler R B，et al.Accelerated onset and increased incidence of ventricular arrhythmias induced by ischemia in Cx43-deficient mice［J］.Circulation，2000，101（5）：547-552.