GC法測定不同產地五味子藤莖中揮發油含量

2015-09-06 01:03:40徐思思徐惠芳

山西中醫藥大學學報 2015年4期

徐思思，徐惠芳

（武漢市中醫醫院，湖北武漢430010）

五味子為木蘭科五味子屬多年生木質藤本，主產于遼寧、黑龍江、吉林等省，俗稱“北五味子”。具益氣生津、補腎養心、收斂固澀的功效［1］。五味子中主要含有多糖、揮發油和木脂素類成分等［2］。五味子藤莖為其干燥藤莖，人們常把曬干的藤莖代替花椒，習稱“山花椒藤”［3］。五味子藤莖曬干后有優良的保健、調味功效［4］。

目前對五味子果實及種子的研究較多［5-6］，而五味子藤莖揮發油方面的研究則相對較少［7-8］。揮發油中主要含大量倍半萜烯成分，其中蒎烯對白色念珠菌有明顯的抑菌與殺菌作用，以及抗氧化、抗衰老作用［9］；檸檬烯具有抑菌活性與誘導癌細胞凋亡作用［10］；月桂烯和蒎烯是合成萜類單體香料的重要原料。本研究側重對不同栽培環境下五味子藤莖中揮發油含量進行研究，為五味子的藥食兩用提供可靠的科學依據。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑

五味子藤莖材料主要采集于東北及華北地區野生品，經湖北中醫藥大學藥用植物教研室陳科力教授鑒定為木蘭科植物五味子的藤莖。藥材經洗凈后，自然干燥，粉碎過40目篩，備用。

對照品：α-蒎烯（批號：110897-200502，含量≥99%，中國食品藥品檢定研究院）、β-蒎烯（批號：YA0402SB13，含量≥99%，上海源葉生物科技有限公司）、月桂烯（批號：YA0402SA13，含量≥85%，上海源葉生物科技有限公司）、檸檬烯（批號：20130116，含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、正十三烷（批號：CAS＃629-50-5，含量≥99%，上海源葉生物科技有限公司）。正己烷為色譜級，乙醚、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析級。

1.2 實驗儀器

Agilent 6890N氣相色譜儀，FID檢測器，石英毛細管柱（大連中匯達科學儀器有限公司），Agilent化學工作站，SARTORIUS-CP225D十萬分之一天平（德國SARTORIUS公司）。揮發油提取器，萬能粉碎機（北京普諾眾達科技有限公司），ME104E型電子分析天平（梅特勒-托利多公司），KD-DTC3102型電子分析天平（梅特勒-托利多公司），電子調溫電熱套（北京科華實驗儀器有限公司），微量進樣器等。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.32 nm×0.5 μm）；檢測器：FID；進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：250℃；程序升溫：柱溫從50℃開始，以8℃/min升溫至 130 ℃；載氣：N2；流速：1.0 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比 10∶1；進樣量：1 μL。理論板數按 α-蒎烯計算大于10000。對照品和樣品色譜圖見圖1［11-12］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內標溶液的配制取正十三烷適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用色譜級正己烷稀釋至刻度線，搖勻，配成濃度為10.19 mg/mL的內標溶液。

圖1 五味子藤莖樣品（A）和對照品（B）色譜圖

2.2.2 供試品溶液配制精密稱取一定粉碎度的五味子藤莖粉末50.00 g，置1000 mL圓底燒瓶中，參照2010版《中國藥典》第一部附錄XD揮發油測定法。加一定比例的水與碎瓷片數片，振搖，混合后連接揮發油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加入飽和氯化鈉溶液使充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶為止。置電子調溫電熱套上浸泡一定時間，之后緩緩加熱至沸，并保持微沸約數小時。提取完畢后，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將氯化鈉溶液緩緩放出，至油層上端到達刻度0線上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其下端恰與刻度0線平齊。讀取揮發油量，收集揮發油于2 mL EP管中，加適量無水硫酸鈉脫水，密閉，振搖，至烘箱中45℃靜置5 h。加2 mL乙醚于揮發油提取器中，緩緩振搖，使黏附于壁上的揮發油溶于乙醚中，收集乙醚萃取液于2 mL EP管中，加少量無水硫酸鈉脫水，常溫揮干乙醚。待兩管中揮發油變成澄清的淡黃色后，合并。將脫水后的純凈揮發油置于5 mL量瓶中，加入內標溶液0.1 mL，加色譜級正己烷定容至刻度，搖勻，即得，備用［9］。

2.2.3 對照品溶液制備分別取對照品α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和檸檬烯適量，精密稱定，置于2 mL容量瓶中，分別加色譜級正己烷稀釋至刻度線，搖勻，配成濃度分別為 5.46 mg/mL，6.92 mg/mL，6.45 mg/mL，5.45 mg/mL的對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察分別用相應量程移液槍精密吸取 α-蒎烯對照品母液 0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.30 mL；β-蒎烯對照品母液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL；月桂烯對照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL；檸檬烯對照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL，將上述溶液依次對應分別置于5 mL量瓶中，精密加入內標溶液0.1 mL，再加正己烷（色譜級）稀釋至刻度線，搖勻，吸取1 μL進樣測定。以各對照品溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），以對照品與內標峰面積的比值作為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

α-蒎烯所得回歸曲線方程為：Y=9.178X-0.0463，R2=0.9997；實驗結果表明進樣濃度在0.0218 mg/mL~0.3280 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

β-蒎烯所得回歸曲線方程為：Y=11.02X-0.0196，R2=0.9994；實驗結果表明進樣濃度在0.0692 mg/mL~0.6920 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

月桂烯所得回歸曲線方程為：Y=5.082X-0.034，R2=0.9998；實驗結果表明進樣濃度在0.0129 mg/mL~0.2580 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

檸檬烯所得回歸曲線方程為：Y=13.56X-0.0852，R2=0.9996；實驗結果表明進樣濃度在0.0109 mg/mL~0.2180 mg/mL范圍內具有良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液1 μL，按上述2.1項下色譜條件同法進樣（n=6），記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯與內標物的峰面積比值，并計算RSD值。結果4種對照品峰面積比的RSD依次為1.42%、1.71%、0.95%、1.87%，結果表明精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗精密吸取同一供試品溶液1 μL，室溫放置，于 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h 時間點分別進樣，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯與內標物的峰面積比值，并計算RSD值。結果4種對照品峰面積比的RSD分別為1.03%，1.34%，1.48%，1.79%。結果表明在12 h內樣品溶液穩定性表現良好。

2.3.4 重復性試驗取同一樣品藥材6份，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按上述2.1項下色譜條件同法進樣 1 μL（n=6），計算 α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和檸檬烯的平均含量分別為 15.47 μg/g，101.50 μg/g，15.86 μg/g，4.74 μg/g；RSD 分別為 1.45%，1.62%，1.28%，1.81%。結果表明重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗選取已知含量的同一樣品五味子藤莖粉末，每份約50.00 g，精密稱量，分別加入 α-蒎烯 50 μL、β-蒎烯 0.5 mL、月桂烯 50 μL、檸檬烯20 μL上述2.2.3對照品溶液，按2.2.2方法制備，平行操作此過程，制得6份加樣回收率試驗供試品溶液，按上述2.1項下色譜條件同法進樣1 μL測定，計算回收率。實驗結果見表1。