星點(diǎn)及正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選穿龍薯蕷總皂苷的提取工藝

陳惠雪

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北武漢430010）

穿龍薯蕷為薯蕷科薯蕷屬多年生草質(zhì)藤本植物，主產(chǎn)于黑龍江、吉林和遼寧省東部山區(qū)。穿龍薯蕷以根莖入藥，穿山龍性溫，味甘、苦，具有舒筋活血、止咳化痰、祛風(fēng)止痛等作用［1］。現(xiàn)代研究證實(shí)其具有良好的抗腫瘤、降血脂等作用［2-5］。

近年來(lái)穿龍薯蕷已經(jīng)作為合成甾體激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的重要工業(yè)原料［6］，穿龍薯蕷的有效成分主要為甾體皂苷類，包括薯蕷皂苷（dioscin）、纖細(xì)皂苷（gracillin）和水溶性皂苷等［7］。市售產(chǎn)品有穿山龍注射液、地奧心血康膠囊和地奧配質(zhì)等，具有很好的藥用價(jià)值與開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種設(shè)計(jì)方法優(yōu)化穿龍薯蕷總皂苷的提取方法，確定其最優(yōu)提取工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐提供實(shí)際參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

UV2100紫外可見(jiàn)分光光度儀（島津國(guó)際貿(mào)易有限公司），SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華有限公司），JD60-4型電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司），薯蕷皂苷（批號(hào)：111707-201208，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥98%），其余試劑為分析純。材料來(lái)源于吉林省，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室尹海波教授鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外測(cè)定方法的系統(tǒng)性研究

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品適量于10 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解，并定容至刻度線，制得濃度為0.6553 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取原藥材粉末（過(guò)40目）約5.00 g，置200 mL圓底燒瓶中，按本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)劃分別進(jìn)行提取，濾液經(jīng)真空抽濾，殘?jiān)^續(xù)提取1次，合并2次濾液并濃縮定容于25 mL量瓶中，搖勻。棄去初濾液（0.45 μm濾膜），取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.1.3 測(cè)定方法及波長(zhǎng)的選擇 精密移取供試品溶液1.0 mL置于密閉具塞試管中，揮干溶劑，再分別加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密閉，置65℃水浴鍋中顯色20 min，取出后以冰水浴冷卻5 min，最后再加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min。以空白試劑為參比溶液，用UV2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于190～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為457 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，0.9 mL，1.0 mL 至 5 支具塞比色管中，按上述“2.1.3項(xiàng)”下測(cè)定方法，同法制備，于457 nm處測(cè)定其吸光度A值。分別以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程如下：Y=19.349X-0.0104，R2=0.9997，結(jié)果顯示，穿龍薯蕷薯蕷皂苷線性在0.0437～0.1092 mg/mL范圍內(nèi)良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液，于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行測(cè)定，其吸光度值分別為 0.545、0.556、0.549、0.542、0.551、0.539，其RSD為1.14%。結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 同一薯蕷皂苷對(duì)照品稀釋液，在上述方法下同法同量連續(xù)測(cè)定5次，記錄吸光度值并計(jì)算其RSD值。其吸光度值分別為0.534、0.552、0.538、0.537、0.541，結(jié)果其RSD為1.29%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的藥材5.0 g，分別加入 4 mg、5 mg、6 mg對(duì)照品（80%、100%、120%），按照上述“2.1.2項(xiàng)”下制備方法，分別平行制備3份，所得加樣回收率平均值分別為100.3%、98.8%、101.4%，其RSD為1.31%。

2.2 穿龍薯蕷回流提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道研究，實(shí)驗(yàn)固定提取為2次［8-9］。本實(shí)驗(yàn)采用回流提取法，選用乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）為4個(gè)考察因素，用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，總皂苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)下表1。

結(jié)果分析：①宏觀分析：由極差R的大小，得知各因素對(duì)總皂苷含量影響程度的大小為A>D>B>C，即乙醇濃度為最重要的影響因素，其余依次為提取溫度、料液比、提取時(shí)間，最佳提取工藝為A2D2B3C2。②方差分析：經(jīng)過(guò)SPSS 19.0軟件分析，結(jié)果顯示，乙醇濃度和提取溫度對(duì)總皂苷含量有顯著影響（表2）。綜合宏觀分析及生產(chǎn)實(shí)踐，故確定其最佳提取工藝為20倍量75%的乙醇85℃下回流提取2 h。

表1 正交試驗(yàn)表

表2 方差分析結(jié)果

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 為保證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重現(xiàn)性，在此最佳提取條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總皂苷含量分別為27.24 mg/g、26.65 mg/g、26.83 mg/g，平均含量為 26.91 mg/g。

2.2.3 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合前期單因素與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)固定提取溫度為85℃，固定提取2次，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）和提取時(shí)間（C）作為考察因素。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每因素設(shè)5個(gè)水平，用代碼值-α、-1、0、1、α 來(lái)表示（α=1.732）。實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.3.1 二次回歸擬合及方差分析 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Design Expert 8.0軟件，以總皂苷含量（R1）為因變量，對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。并由軟件分析的回歸系數(shù)擬合其回歸方程（編碼值）。R1=26.35+1.68A+0.71B+1.64C-0.39×AB-0.98AC+0.41BC-1.88A2-1.47B2-1.24C2。

從模型及系數(shù)方差分析可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），失擬（P＞0.05）不顯著，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以使用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)價(jià)（表4）。本模型響應(yīng)面分析圖，見(jiàn)圖1～圖3。

2.2.3.2 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)，得到穿龍薯蕷總皂苷含量的最佳提取工藝條件為乙醇濃度77.25%，料液比15.84，提取時(shí)間130.49 min，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為27.17 mg/g。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重現(xiàn)性，采用此最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的簡(jiǎn)便，綜合選取乙醇濃度為77%，料液比為16，提取時(shí)間為130 min，結(jié)果響應(yīng)值為27.08 mg/g，與理論值的誤差為0.09 mg/g，符合實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐要求。

表3 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 （mg/g）

表4 模型及系數(shù)方差分析

3 討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)法已在國(guó)內(nèi)進(jìn)行多方面應(yīng)用，而傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)仍然存在，原因在于實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，實(shí)驗(yàn)信息豐富，可知曉試驗(yàn)因素對(duì)因變量影響的程度大小［10］。正交實(shí)驗(yàn)最佳提取工藝為20倍量75%的乙醇85℃下回流提取2 h，而星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最佳提取工藝為：乙醇濃度77.25%，料液比15.84，提取時(shí)間130.49 min。

圖1 料液比與提取時(shí)間對(duì)總皂苷含量影響的三維曲面圖

圖2 乙醇濃度與料液比對(duì)總皂苷含量影響的三維曲面圖

圖3 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總皂苷含量影響的三維曲面圖

本實(shí)驗(yàn)主要采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，便于工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐的中間過(guò)程控制及成品檢測(cè)控制，可為穿龍薯蕷總皂苷的生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論依據(jù)。

穿龍薯蕷皂苷類化合物藥理作用研究廣泛，應(yīng)用于甾體激素藥物和抗冠心病皂苷類藥物的合成原料或中間體，具有良好的市場(chǎng)前景及可觀的經(jīng)濟(jì)效益。故本文主要通過(guò)兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)選穿龍薯蕷總皂苷的提取工藝，并綜合考慮確定穿龍薯蕷總皂苷的最佳提取工藝為：乙醇濃度為75%，料液倍數(shù)為16，提取時(shí)間為130 min/次，提取溫度為85℃。

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