丙戊酸鈉對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

李蕓子，邱晶，孫競，高靜（江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013）

丙戊酸鈉對魚藤酮誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

李蕓子，邱晶，孫競，高靜
（江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013）

目的：觀察丙戊酸鈉對魚藤酮誘導的神經母細胞瘤 SH-SY5Y細胞損傷的影響并探討其分子機制。方法：100 μmol/L丙戊酸鈉作用 SH-SY5Y細胞3 h后，使用 400 nmol/L魚藤酮處理24 h誘導 SH-SY5Y細胞損傷。采用MTT法檢測細胞存活率；分光光度法檢測線粒體復合體Ⅰ（mitochondrial complexⅠ，COXⅠ）活性；蛋白質印跡法檢測酰基輔酶 A心磷脂酰基轉移酶（Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1）、沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）、核受體過氧化酶體 增殖子激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）的表達水平；RT-PCR法檢測PGC-1α mRNA轉錄水平。結果：預防性給予丙戊酸鈉能明顯提高魚藤酮損傷的 SH-SY5Y細胞存活率，下調ALCAT1的表達水平，增強 COXⅠ的活性，并上調SIRT1及 PGC-1α的表達水平，但對 PGC-1α mRNA轉錄水平無明顯影響。結論:丙戊酸鈉對魚藤酮誘導的 SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用。

丙戊酸鈉；酰基輔酶 A心磷脂酰基轉移酶；線粒體復合體Ⅰ；沉默信息調節因子1；PGC-1α

［Abstract］Objective:To study the effect and the molecular mechanism of sodium valproate on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells.Methods:After pretreatment of 100 μmol/L sodium valproate，SHSY5Y cells were treated with 400 nmol/L rotenone；MTT assay was used to analyze cells viability；spectrophotometry was used to check mitochondrial complexⅠactivity；the expression of Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1（ALCAT1），silent information regulator 1（SIRT1）and peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α（PGC-1α）were checked by Western blot；mRNA level of PGC-1α was analyzed by RT-PCR.Results:Pretreatment of 100 μmol/L sodium valproate for 3 h in SH-SY5Y cells could significantly increase cells viability，inhibit the expression of ALCAT1，elevate the activity of mitochondrial complexⅠ，increase the expression of SIRT1 and PGC-1α，but had no effect of mRNA level of PGC-1α.Conclusion:Sodium valproate had protective effect on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells.

［Key words］sodium valproate；Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1；mitochondrial complexⅠ；silent information regulator 1；PGC-1α

帕金森病是一種與年齡相關的神經退行性疾病［1］。研究顯示，線粒體復合體Ⅰ（mitochondrial complexⅠ，COXⅠ）活性與帕金森病的發生密切相關［2］，導致帕金森病病理損傷過程中 COXⅠ活性下降的機制目前還不是很清楚。有研究指出心磷脂對于COXⅠ活性的維持是必需的［3］。而且，心磷脂對參與線粒體氧化磷酸化過程的很多關鍵酶活性具有重要的調控作用，這其中就包括對COXⅠ活性的調節［3］。酰基輔酶A心磷脂酰基轉移酶（Acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1）是一種參與心磷脂重塑的酰基轉移酶，當心磷脂的酰基鏈結構發生改變時，即心磷脂重塑后可進一步引起線粒體功能紊亂，進而觸發多種神經退行性疾病的發生［4-5］。

沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）屬于Ⅲ型核組蛋白脫乙酰酶，是目前研究最為透徹的核組蛋白脫乙酰酶［6］。在哺乳動物中，SIRT1的活性依賴于NAD+［7］。線粒體對各種營養物質進行多級氧化反應產生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）直接通過 COXⅠ進行再氧化生成NAD+。因此，細胞內COXⅠ的功能可以影響NAD+量的變化，進而影響SIRT1的活性。

研究表明SIRT1參與了非組蛋白底物的脫乙酰化，這些非組蛋白包括核受體過氧化酶體 增殖子激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α）［8］。PGC-1α對線粒體的合成及其功能的維持有著關鍵作用。PGC-1α在腦組織中高表達，通過整合線粒體合成與維持線粒體功能等多條途徑，保護老化細胞［9］。最新研究表明［10］，激活或過表達神經元中的 PGC-1α可明顯增加神經元細胞內線粒體的密度；此外，PGC-1α也可通過上調線粒體內超氧化物歧化酶 2等多種抗氧化酶的轉錄水平，對抗細胞氧化應激損傷。因此 PGC-1α也被認為是一種具有神經保護作用的細胞內重要的抗氧化調節因子［11］。

丙戊酸鈉是臨床上治療癲癇的經典藥物。本實驗室前期研究［12］發現，丙戊酸鈉具有明顯的保護線粒體功能的作用。為進一步研究丙戊酸鈉在帕金森病樣損傷狀態下對細胞及線粒體功能具有保護作用的分子機制，本研究采用從醉魚豆屬植物毛魚藤的根和葉中提取出的 COXⅠ選擇性抑制劑魚藤酮作用于SH-SY5Y細胞，構建帕金森病樣細胞損傷模型，并從細胞存活率、COXⅠ活性、ALCAT1、SIRT1 及PGC-1α表達量等方面觀察丙戊酸鈉保護帕金森病樣損傷細胞的分子機制，為將丙戊酸鈉作為神經保護劑應用于預防和治療帕金森病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

CO2孵箱（德國Heraeus公司）；SpectraMax 190酶標儀（美國Molecular Devices公司）；冷凍離心機美國 Beckman Coulter公司）；Mini-PROTEAN 3電泳系統（美國Bio-Rad公司）；PCR儀（Gene公司）；蛋白核酸定量儀（島津公司）；DY602S穩流穩壓電泳儀（南京新校園生物技術研究所）。

丙戊酸鈉和魚藤酮均為 Sigma公司產品；MEM∶F12培養基（1∶1，Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（Amresco公司）；COXⅠ酶活性試劑盒（Abcam公司）；Trizol RNA提取試劑盒（寶生物有限公司）；RT-PCR試劑盒（Fermentas公司）；PGC-1α和 GAPDH引物（Invitrogen公司）；抗SIRT1抗體（Santa Cruz公司，1∶200）；抗PGC-1α抗體（Santa Cruz公司，1∶200）；抗β-肌動蛋白抗體（Abcam公司，1∶2 000）；抗ALCAT1抗體（Abcam公司，1∶100）。

1.2 SH-SY5Y細胞的培養

將人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞（中科院上海營養所柯尊記研究員惠贈）接種于裝有含10％胎牛血清的MEM∶F12（1∶1）培養基的培養瓶中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養，2～3天傳代1次。進行實驗時將培養的細胞消化后得細胞懸液，分別接種于6孔、96孔培養板或培養皿中培養，接種時細胞密度為3×104個/mL。

本實驗 SH-SY5Y細胞共設3組，對照組不加藥物，損傷組細胞加入魚藤酮，預處理組細胞培養48 h后，加入100 μmol/L的丙戊酸鈉，繼續培養3 h后加入400 nmol/L的魚藤酮，作用24 h后用于后續實驗。

1.3 MTT法檢測 SH-SY5Y細胞活性

96孔 細胞培養板每孔加100 μL MTT（用D-hank′s液溶解，質量濃度為1 mg/mL），37℃繼續孵育4 h后，吸去培養液，每孔加DMSO 100 μL，待結晶物充分溶解，用酶聯免疫檢測儀于570 nm處測光密度值。

1.4 分光光度法檢測 COXⅠ酶活性

以培養皿培養細胞，吸出培養皿中的培養液，用PBS洗細胞1次，每孔加胰酶消化20 s，將細胞移至離心管中，2 000 r/min離心10 min，沉淀即為細胞。以20 μL細胞沉淀為基準，加入 20 μL RSB低滲緩沖液（NaCl 0.058 44 g，MgCl20.023 75 g，Tris-HCl 0.197 06 g，EDTA 0.730 62 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5）冰上研磨5 min，再加入80 μL 2.5×MS緩沖液（甘露醇9.565 50 g，蔗糖5.990 26 g，Tris-HCl 0.197 06 g，EDTA 0.730 62 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5），再研磨30 s，轉至 Eppendorf管中，再加入100 μL 1×MS緩沖液（甘露醇3.826 20 g，蔗糖2.396 10 g，Tris-HCl 0.078 82 g，EDTA 0.029 20 g，雙蒸水100 mL，pH 7.5）沖洗勻漿管，移至Eppendorf管中，2 000 r/min離心10 min取上清，13 000 r/min離心15 min，上清即為胞質，沉淀為線粒體。將上清液凍干，用PBS溶解，取20 μL進行考馬斯亮藍 G-250蛋白定量。其他操作步驟參考COXⅠ酶活性試劑盒中的說明書進行。用酶標儀檢測30 min內，450 nm處光密度值。

1.5 蛋白質印跡法檢測各組細胞內 ALCAT1、SIRT1及 PGC-1α的表達水平

6孔板培養細胞，輕輕吸出培養基，每孔加入1 mL D-hank′s溶液，用細胞刮子輕輕將貼壁細胞從培養板上刮下，小心重懸細胞后將細胞懸液移入1.5 mL的 Eppendoff管中，4 000 r/min離心5 min，棄上清，加入一定量的細胞裂解液，置冰上裂解 20 min。12 000×g離心2 min，吸上清。取 2～5 μL進行考馬斯亮藍蛋白定量，其余樣品按比例加入3×SDS凝膠上樣緩沖液溶解，煮沸5 min。取適量蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、孵育抗體，化學發光儀曝光觀察蛋白的表達。

1.6 RT-PCR法檢測細胞內 PGC-1α的轉錄水平

采用 Trizol試劑盒提取細胞總 RNA，紫外分光光度計（D260 nm/D280 nm）檢測RNA純度。按照RT-PCR試劑盒說明書將所提 RNA反轉錄成 cDNA，并將 cDNA立即用于 PCR檢測。

引物序列依據文獻［13-14］，人 PGC-1α上游序列:5′-TGAGAGGGCCAAGCAAAG-3′，下游序列: 5′-ATAAATCACACGGCGCTCTT-3′，擴增片段長度為116 bp；人 GAPDH上游序列:5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，下 游 序 列:5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′，擴增片段長度為457 bp。循環條件為95℃預變性 3 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s進行27個循環，72℃再延伸10 min；EB染色，1.5％瓊脂糖凝膠電泳 PCR產物，凝膠成像系統觀察人PGC-1α和GAPDH PCR產物的表達情況。

1.7 統計方法

采用GraphPad Prism 5統計軟件處理數據，3組細胞各個檢測指標間的比較采用單因素方差分析，組間比較應用q檢驗，數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組SH-SY5Y細胞活性的比較

MTT結果顯示，與對照組比較，損傷組細胞活性明顯降低（q=6.815，P＜0.01）；預處理組細胞活性明顯高于損傷組（q=4.272，P＜0.05），與對照組間的差異無統計學意義（q=2.543，P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組SH-SY5Y細胞的活性比較

2.2 各組 SH-SY5Y細胞 ALCAT1表達的比較

蛋白質印跡結果顯示，與對照組比較，損傷組細胞ALCAT1的表達水平明顯升高（q=13.70，P＜0.01）；與損傷組比較，預處理組ALCAT1表達水平明顯降低（q=10.44，P＜0.05）。該結果提示丙戊酸鈉可以通過調控ALCAT1的表達影響心磷脂的重構。見圖2。

圖2 各組細胞 ALCAT1相對表達量的比較

2.3 各組 SH-SY5Y細胞 COXⅠ活性的比較

COXⅠ活性檢測結果顯示，與對照組比較，損傷組細胞COXⅠ活性在15到30 min內明顯降低；與損傷組比較，預處理組細胞 COXⅠ活性各時段均明顯升高。見圖3。

圖3 各組細胞 COXⅠ活性的比較

2.4 各組細胞SIRT1及 PGC-1α表達的比較

采用蛋白質印跡法檢測細胞中SIRT1及PGC-1α表達水平，結果顯示，與對照組比較，損傷組 SHSY5Y細胞中的SIRT1（q=21.65，P＜0.01）及 PGC-1α（q=7.303，P＜0.05）表達水平均明顯下降；與損傷組相比，預處理組中SIRT1（q=12.05，P＜0.01）和PGC-1α（q=6.316，P＜0.05）的表達明顯增加。見圖4。

圖4 各組細胞SIRT1及 PGC-1α相對表達量的比較

2.5 各組細胞 PGC-1α mRNA轉錄水平的比較

RT-PCR檢測結果顯示，3組細胞中PGC-1α mRNA轉錄水平間差異無統計學意義（F值 = 2.333，P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞PGC-1α mRNA轉錄水平的比較

3 討論

本研究采用的COXⅠ抑制劑魚藤酮可在整體和細胞水平上較好地模擬帕金森病發病過程中的重要病理學、行為學變化，是公認的帕金森病損傷模型［15］。本研究成功構建了魚藤酮誘導的細胞損傷，魚藤酮作用后的細胞存活率和 COXⅠ活性明顯降低，給予丙戊酸鈉可明顯改善細胞存活并有效提高細胞 COXⅠ活性。

心磷脂是一種四鏈酰基磷脂，廣泛存在于高等動物、植物和微生物界。在哺乳動物細胞中，心磷脂在線粒體內膜含量豐富［16］。ALCAT1可催化脂酰輔酶 A形成三脂酰心磷脂，即發生心磷脂重構［17］。心磷脂重構發生后一方面將影響線粒體氧化呼吸鏈中重要的氧化磷酸化酶系活力，進而造成線粒體功能障礙；另一方面 ALCAT1可識別遭受活性氧攻擊后產生的心磷脂重塑靶蛋白，使其結構進一步改變，造成惡性循環［18］。研究顯示，氧化應激和線粒體失能均可導致 ALCAT1過表達，進而增加相關疾病發生的危險［19］，而抑制 ALCAT1的表達可改善氧化應激損傷［18］。本研究結果與以上報道一致的是魚藤酮作用后細胞中的 ALCAT1表達水平較對照組明顯上調。同時本研究發現丙戊酸鈉預處理可明顯下調魚藤酮誘導損傷細胞中的 ALCAT1表達，提示丙戊酸鈉改善魚藤酮誘導的細胞 COXⅠ活性下降與下調ALCAT1表達水平有關。

在帕金森病的病理進程中，因 COXⅠ氧化水平被抑制，NADH生成的NAD+下降，并導致受NAD+調控的SIRT1脫乙酰酶活性顯著降低。研究發現［8，20］，SIRT1可通過與 PGC-1α形成復合物，促進PGC-1α的脫乙酰化，增加其活性，進而增強線粒體的能量代謝及增殖水平。本研究顯示魚藤酮誘導損傷細胞中的SIRT1和 PGC-1α表達水平明顯降低，值得注意的是我們發現丙戊酸鈉預處理可明顯上調魚藤酮誘導損傷細胞中 SIRT1和 PGC-1α表達水平，但丙戊酸鈉對 PGC-1α mRNA轉錄水平無明顯影響，這從側面說明丙戊酸鈉的作用是通過增強SIRT1的表達及SIRT1的脫乙酰酶活性，促進SIRT1 與PGC-1α形成復合體，促進 PGC-1α的脫乙酰化，使得PGC-1α的表達水平增高。我們的研究結果與Nemoto等［8］的報道基本一致。

綜上所述，本研究發現丙戊酸鈉可通過抑制魚藤酮誘導的損傷細胞中ALCAT1的表達，提高COXⅠ的活性進而上調了SIRT1和PGC-1α的表達，發揮其對魚藤酮誘導的損傷細胞的保護作用，具體機制有待于今后進一步的研究。

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Sodium valproate had protective effect on rotenone induced injury in SH-SY5Y cells

LI Yun-zi，QIU Jing，SUN Jing，GAO Jing
（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

R741.05

A

1671-7783（2015）01-0005-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140277

江蘇省自然科學基金資助項目（BK20140574）；江蘇大學高級專業人才科研啟動基金項目（13JDG063，13JDG001）［作者簡介］李蕓子（1988—），女，碩士研究生；高靜（通訊作者），教授，碩士生導師，E-mail:jinggao@ujs.edu.cn

2014-10-22 ［編輯］陳海林