miR-93在急性髓系白血病中的表達及其與 miR-378表達的相關性

湯琴，尹家瑜，朱曉雯，張盈盈，周靜東，鄧兆群（.江蘇大學附屬人民醫院血液科，江蘇 鎮江 22002；2.江蘇大學附屬金壇醫院血液科，江蘇 金壇2200；.江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇鎮江 22002）

miR-93在急性髓系白血病中的表達及其與 miR-378表達的相關性

湯琴1，2，尹家瑜1，朱曉雯1，張盈盈1，周靜東1，鄧兆群3
（1.江蘇大學附屬人民醫院血液科，江蘇 鎮江 212002；2.江蘇大學附屬金壇醫院血液科，江蘇 金壇213200；3.江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇鎮江 212002）

目的：探討微小RNA-93（miR-93）在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表達特點及其與miR-378表達的相關性。方法：用實時定量逆轉錄 聚合酶鏈反應（RQ-PCR）檢測84例AML患者及16例健康對照骨髓單個核細胞中 miR-93成熟體的表達水平。分析 miR-93高表達對 AML患者預后的影響及其與 miR-378表達的相關性。結果：84例 AML患者中有14例過表達 miR-93（16.7％）。miR-93高表達組患者除白細胞數（3.11× 109/L）明顯低于低表達組（14.55×109/L，P=0.003）外，其他參數如性別、年齡、血紅蛋白和血小板等均無明顯差異。與其他核型分組［10/38（26.3％）］比較，中等預后核型分組中 miR-93高表達的頻率明顯下降［4/46（8.7％），χ2=4.652，P=0.041］。Spearman相關系數分析顯示，miR-93表達率與 miR-378表達率呈正相關（r=0.321，P＜0.01）。結論:miR-93在 AML中表達率明顯增加，且與miR-378表達率呈正相關。miR-93聯合 miR-378的表達可能作為 AML診斷的參考依據。

微小 RNA；微小 RNA93；急性髓性白血病

［Abstract］Objective:To investigate the expression of miR-93 in acute myeloid leukemia（AML）patients and the correlation between miR-93 and miR-378.Methods:Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression level of miR-93 in AML patients.The clinical significance of miR-93 expression in AML was investigated.Results:miR-93 overexpression was identified in 14（16.7％）of 84 AML patients.The patients with miR-93 overexpression had lower white blood cell level than those without miR-93 overexpression（3.11×109/L versus 14.55×109/L，respectively，P=0.003）.Compared with other karyotype classifications，the frequency of miR-93 overexpression in the intermediate ones was lower［4/46（8.7％）versus 10/38（26.3％），P=0.041］.Spearman correlation analysis revealed positive association between the two miRNAs，with r=0.321 between miR-93 and miR-378.Conclusion: miR-93 might serve as a diagnostic molecule with miR-378 in AML.

［Key words］microRNA；miR-93；acute myeloid leukemia

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，表現為造血祖細胞的分化和增殖異常，從而導致致命性的感染、出血、器官浸潤等［1］。微小RNA是一類長度約為20～22 nt的真核生物內源性小分子非編碼單鏈RNA，參與人體內多種重要的生理過程，包括細胞的分化、增殖和凋亡等［2］。近年來研究顯示，微小RNA與 AML的發生發展密切相關。miR-93能夠促進腫瘤的生長、血管的形成以及細胞的增殖［3-4］。miR-93的表達在神經母細胞瘤、非小細胞肺癌以及乳腺癌中均明顯增高，且與胃癌的預后密切相關［5-8］。眾多研究表明，miR-93和 miR-378都是促癌基因［3，9］。但是，miR-93在AML中的表達狀況及其與 miR-378表達的相關性尚未見報道。我們檢測了急性髓性白血病患者骨髓單個核細胞中miR-93的表達量，并對其與 miR-378表達的相關性進行了分析。

1 對象與方法

1.1 病例

84例AML患者均為2005年10月至2014年3月在江蘇大學附屬人民醫院接受住院治療的初診病例，其中男48例，女36例，年齡10～87歲（中位53歲），診斷按 FAB和WHO 2008版標準（原始細胞≥20％）［10-11］。核型分析應用常規 R顯帶技術，核型分組按照文獻［12］進行。對照組16例為疑似白血病患者，后經骨髓穿刺病理學后而排除，且未患其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離與 RNA制備 全部患者均于初診時抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用 Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，應用 mirVana miRNA試劑盒提取總RNA（Ambion公司，美國），經紫外分光光度儀檢測 RNA濃度及純度［D（260 nm）/D（280 nm）比值在1.8～2.0間］，-80℃保存備用。

1.2.2 反轉錄

20 μL反應體系包括蒸餾水14 μL、緩沖液4 μL、RNA 1 μL、反轉錄酶1 μL（Qiagen公司，miScript Reverse Transcription Kit Cat.218061）混勻離心。PCR程序包括兩步:①37℃1 h，②95℃5 min，隨后4℃保持。

1.2.3 RQ-PCR檢測樣品中 miR-93成熟體的表達

引物設計采用 Primer Premier 5.0軟件，miR-93特異引物序列為5′-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGT-3′。內參為U6管家基因，上游引物為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 為 5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海基康生物技術有限公司合成。20 μL PCR反應體系包括賽博綠 PCR混合溶液10 μL，1.0 μmol/L的通用引物2 μL，以及1.0 μmol/L的特異性上游引物。反應在ABI 7300擴增儀（Applied Biosystems公司，美國）上進行，擴增條件為95℃預變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸34 s，共40個循環，熔解曲線程序為95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，60℃15 s。每次擴增均以重組 miR-93質粒為陽性對照，以雙蒸水作為無模板對照（NTC）。選取 miR-93與U6表達ΔCT值最小的1例對照標本作為參比對照，設定為1。miR-93基因表達量的計算采用如下公式:；ΔCT指對照與標本之間miR-93與 U6循環閾值（CT）的差值。熔解曲線揭示PCR產物為單一峰。隨機選取2例 PCR產物進行測序證實序列正確。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理。計量資料間的差異分析采用 Kruskal-Wallis（多組間比較）或 Mann-Whitney U檢驗（兩組比較），計數資料的差異分析采用卡方檢驗或 Fisher確切概率法；miR-93表達與臨床資料之間的相關性分析采用Spearman秩和檢驗；生存時間分析采用 Kaplan-Meier法；用 Spearman相關系數分析 miR-93與 miR-378的相關性；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-93在兩組中的表達

16例對照的 miR-93表達水平在0.001316～1.000000（0.19±0.24）。因此，以0.43（均數 +標準差）為界將 AML組分為高表達組和低表達組。84 例AML患者中有14例（16.7％）為過表達miR-93。相應對照組 miR-93的高表達率為6.25％（1/16）。對照組和 AML組的 miR-93的表達水平差異無統計學意義。

miR-93高表達組白細胞計數明顯低于低表達組（P=0.003），兩組其他參數如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統計學意義。見表1。AML組每個亞型都有 miR-93高表達的病例，但各型之間的高表達率無統計學意義。與其他核型分組［10/38（26.3％）］比較，中等預后組中 miR-93高表達的頻率明顯降低［4/46（8.7％），P=0.041］。

2.2 miR-93對預后的影響及與 miR-378的相關性

為了觀察AML患者中 miR-93高表達對患者預后的影響，我們對 84例患者中的 80例患者（失訪4例）進行了生存分析，其中高表達組14例，低表達組66例。在完全緩解的43例中高表達組9例（64.3％），低表達組34例（51％）。兩組完全緩解率間的差異無統計學意義（P=0.566）。所有患者中，生存總人數為34例，其中高表達組6例，低表達組28例，兩組（又各有1例失訪）的總體生存率的差異也無統計學意義［46％（6/13）與 43％（28/ 65），χ2=0.292，P=0.589］。在獲得完全緩解的AML患者中，miR-93高表達組和低表達組無復發生存率的差異也無統計學意義［75％（6/8）與84％ （27/32），χ2=0.341，P=0.559］。Spearman相關系數分析結果顯示，miR-93與miR-378之間有明顯相關性（r=0.321，P＜0.01）。見圖1。

表1 急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞miR-93表達水平與臨床參數的關系

3 討論

AML的致病機制與染色體異常和蛋白編碼基因等密切相關。近年來，miRNA在 AML發生發展中的作用以及調控機制已經成為研究的熱點和焦點之一。多數研究表明 miR-93能夠促進多種腫瘤的發生發展［3，8，13］。但miR-93在 AML中的作用機制還不明確。

圖1 Spearman相關系數分析miR-93與miR-378間的相關性

本研究測定了84例 AML患者以及16例對照的骨髓單個核細胞中miR-93的表達水平，并進行統計分析。結果顯示，84例AML患者中有14例為過表達 miR-93（16.7％），提示 miR-93表達可能作為診斷AML的生物分子，今后需要更多病例進行驗證并進行 miR-93與 AML的相關性研究。miR-93高表達組與低表達組相比，除了白細胞計數低以外（3.11×109/L與14.55×109/L，P=0.003），其他參數如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統計學意義。Zhu等［14-15］通過測定患者血清 中的miR-93以及其他一些微小RNA的表達水平，推斷可以將多種微小 RNA一起作為非小細胞肺癌和AML的分子診斷學依據。Spearman相關系數分析得出 miR-93與 miR-378具有正相關性（r=0.321，P＜0.01）。而我們以前的研究表明 miR-378對AML的發生發展以及預后可能有重大的意義［16］。miR-378和 miR-93已經被證實與腫瘤的形成相關［3，9］。此次研究雖未有明確的數據證明 miR-93 對AML患者的預后有影響，但是miR-93與miR-378之間呈正相關，且在預后中等核型分組中 miR-93高表達的頻率更低。因此，我們認為miR-93在AML中出現過表達及與 miR-378表達正相關，聯合檢測miR-93和miR-378的表達有可能作為 AML診斷的參考依據。

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Expression of miR-93 in AML and association between miR-93 and miR-378

TANG Qin1，2，YIN Jia-yu1，ZHU Xiao-wen1，ZHANG Ying-ying1，ZHOU Jing-dong1，DENG Zhao-qun3
（1.Department of Hematology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.Department Of Hematology，the Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200；3.Laboratory Centre，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

R733.71

A

1671-7783（2015）01-0068-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140262

國家自然科學基金資助項目（81172595，81270630）；江蘇省臨床醫學科技專項基金資助項目（BL2012056）；江蘇省“333工程”科研項目資助計劃（BRA2011085，BRA2013136）

湯琴（1972—），女，江蘇金壇人，碩士研究生；鄧兆群（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail，dengqian2012@gmail.com

2014-10-10 ［編輯］陳海林