Matrigel三維培養下卵巢癌細胞生長狀況觀察

蔡國徽，韓云竹，唐富山，宋鴻（遵義醫學院微生物學教研室，貴州 遵義 563099）

CAI Guo-hui，HAN Yun-zhu，TANG Fu-shan，SONG Hong（Department of Microbiology，Zunyi Medical College，Zunyi Guizhou 563099，China）

Matrigel三維培養下卵巢癌細胞生長狀況觀察

蔡國徽，韓云竹，唐富山，宋鴻
（遵義醫學院微生物學教研室，貴州 遵義 563099）

目的：建立 Matrigel卵巢癌細胞三維培養模型，觀察Matrigel三維培養條件下卵巢癌細胞的形態、功能及增殖狀況。方法：Matrigel三維培養卵巢癌細胞，采用倒置顯微鏡觀察卵巢癌細胞的生長情況，鬼筆環肽/DAPI染色觀察細胞形貌，鈣黃綠素AM染色評價細胞活力，通過測定DNA含量了解細胞增殖情況，ELISA檢測血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和胰島素樣生長因子1 （insulin-like growth factors 1，IGF1）等卵巢癌相關因子的分泌情況。結果：與二維培養條件相比，卵巢癌細胞在 Matrigel中成團生長，且活力及增殖狀態好，并能較好地分泌卵巢癌細胞相關因子。結論:Matrigel三維培養體系能較好地維持卵巢癌細胞的形態、功能及增殖能力。

三維培養；Matrigel；卵巢癌細胞

CAI Guo-hui，HAN Yun-zhu，TANG Fu-shan，SONG Hong
（Department of Microbiology，Zunyi Medical College，Zunyi Guizhou 563099，China）

［Abstract］Objective:To establish the three-dimensional（3D）culture model of ovarian cancer by means of Matrigel as scaffolds and to study the cellular morphology，function and proliferation.Methods: The morphology，distribution and viability of ovarian cancer cells in three dimensional culture were identified by fluorescence microscopy；Phalloidine/DAPI staining was used to assess the cellular morphology；The cell viability was measured by calcein AM staining；the cell proliferation was measured by measuring the content of DNA in cells；ELISA assay was used to assess the secretion status of associated factors（VEGFA，EGF and IGF-1）in ovarian cancer cell.Results:Cells grown in Matrigel formed multicellular colonies and good ability and biocompatibility with the matrix.The associated factors（VEGFA，EGF and IGF-1）in ovarian cancer cells assay indicated that there were significant differences of their secreation in three dimensional culture compared to two dimensional culture.Conclusion:Three dimensional culture of ovarian cancer cells in Matrigel matrix could maintain the cells morphology，function and proliferation better.

［Key words］three dimensional culture；Matrigel；ovarian cancer cells

卵巢癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤之一，死亡率居女性生殖系統惡性腫瘤的第1位，5年生存率僅為 30％左右［1］。由于卵巢癌病理類型復雜，體內直接研究卵巢癌細胞的生物學特性受多種因素的影響，因此，建立一種模擬體內卵巢癌細胞生長微環境的培養模型對體外研究卵巢癌的發生、發展尤為重要［2］。體外細胞三維（three-dimensional，3D）培養是介于二維（two-dimensional，2D）培養與動物實驗之間的實驗技術，不僅可滿足體外研究的直觀性及條件可控性，而且能模擬體內細胞生長的三維形態結構和功能［3］。目前已有多種動物來源及人工合成的支架材料用于體外細胞三維培養［4］。本研究以Matrigel作為支架材料，建立卵巢癌 A2780和人高轉移卵巢癌 HO8910PM細胞株三維培養模型，觀察三維培養下兩株卵巢癌細胞的生長情況、細胞活力和增殖情況，并檢測血管內皮生長因子 A（vascu-lar endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factors 1，IGF1）等卵巢癌相關因子的分泌情況，為今后卵巢癌體外研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清美國 Gibco公司）；人卵巢癌 A2780細胞系購自南京賽博生物科技有限公司，人高轉移卵巢癌HO8910PM細胞株購自美國模式菌種收集中心ATCC）；Matrigel（美國BD公司）；DNA熒光定量檢測試劑盒、DAPI、羅丹明鬼筆環肽、鈣黃綠素 AM均為美國Sigma公司產品；ELISA試劑盒（美國Uscn公司）。

1.1.2 主要儀器 3131型 CO2培養箱和 3001-1913型 Varioskan Flash（美國 Thermo公司），IX71型熒光倒置熒光顯微鏡、酶標儀（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 單層細胞培養 0.25％胰酶消化細胞，于37℃，5％CO2及飽和濕度常規培養，待細胞融合至80％時，消化細胞進行下一步實驗。

1.2.2 三維細胞培養 取生長狀態良好的單層培養細胞，0.25％胰酶消化，調節細胞密度為 2×106/ mL，冰浴下按1∶1比例與Matrigel混合后快速接種于24孔板內的自制模具中，37℃孵育30 min后取出模具，向24孔板中加入適量完全RPMI-1640培養液，37℃，5％CO2及飽和濕度常規培養，隔天換液。1.2.3 細胞形貌觀察 每日在倒置顯微鏡下觀察Matrigel中卵巢癌細胞形態及增殖情況并拍照，在培養第6天取細胞 凝膠團，用預溫PBS洗滌2次，4％低聚甲醛常溫固定15 min，PBS洗3次，0.1％Triton X-100處理5 min，PBS洗3次，將8 μg/mL羅丹明鬼筆環肽加入細胞樣品中作用 20 min，PBS洗滌后向細胞樣品中加入適量0.5 μg/mL DAPI，室溫孵育5 min，吸棄多余液體，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 鈣黃綠素 AM染色檢測細胞活力 細胞在Matrigel基質中分別培養 3，6，9 d，預冷的 PBS洗 3次，每次15 min，以去除或稀釋血清中的酯酶活性。取2 μmol/L的鈣黃綠素AM工作液添加到三維細胞培養凝膠中至完全淹沒凝膠，室溫孵育45 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 DNA含量測定法評價細胞增殖 0.25％胰酶消化細胞，調整細胞密度在（0～25）×106/mL范圍內至少 5個濃度點，置于含 5×10-3mol/L枸櫞酸鈉和100×10-3mol/L氯化鈉的枸櫞酸鹽緩沖液中，-80℃反復凍融、振蕩直至完全溶解，按DNA熒光定量試劑盒說明書測定 DNA含量，以細胞密度為縱坐標，所得 DNA含量為橫坐標繪制校正曲線。三維培養卵巢癌細胞到第3、6、9天時，PBS漂洗 2次，取出細胞 凝膠團置于枸櫞酸鹽緩沖液中，-80℃儲存備用。實驗前反復凍融并振蕩直至完全溶解，測定DNA含量，根據細胞密度與 DNA含量之間的校正曲線計算細胞量。

1.2.6 ELISA檢測VEGFA、EGF和IGF1的表達

Matrigel三維培養卵巢癌細胞，到第4天時更換培養液，每孔加800 μL完全 RPMI-1640培養液，到第6天時，取出細胞培養液，2 000×g離心 20 min，取上清液分裝到1.5 mL EP管中備用。按照ELISA試劑盒說明書對樣本進行處理，酶標儀檢測450 nm波長處的光密度值，并與二維培養細胞作對比。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計學軟件。所有實驗均重復3次以上，計量資料用 ˉx±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形貌

通過倒置顯微鏡觀察卵巢癌細胞單層培養及在Matrigel基質中的生長形態。單層培養條件下卵巢癌細胞4 h開始貼壁，24 h完全貼壁，細胞呈多邊形，培養2～3 d細胞融合可達 80％，4～5 d可達100％融合，第6天以后大部分細胞開始老化，脫落。與單層培養卵巢癌細胞明顯不同，在 Matrigel基質中細胞均勻分布于基質材料中，到第 3天時細胞開始形成明顯的不規則狀細胞團，隨著培養時間的延長，細胞團逐漸增大，培養液內未見漂浮的死細胞，見圖1。三維培養 6 d后鬼筆環肽/DAPI染色可明顯分辨Matrigel中卵巢癌細胞的形貌:紅色部分為細胞骨架的F-肌動蛋白（F-actin），藍色部分為 DAPI染色的細胞核。提示Matrigel三維細胞培養模型的建立使得卵巢癌細胞在細胞外基質微環境中形成了具有三維梯度的多細胞群，見圖2。

圖1 卵巢癌細胞單層培養及在 Matrigel中培養的明場圖（×100）

圖2 卵巢癌細胞在 Matrigel中培養第 6天的 F-肌動蛋白及細胞核的熒光復染圖（×200）

圖3 Matrigel中培養的卵巢癌細胞鈣黃綠素AM熒光染色（×100）

2.2 細胞存活力

三維培養第3、6、9天進行鈣黃綠素 AM染色可見，隨著培養時間的延長細胞團逐漸增大，處于不同梯度的細胞均呈現綠色熒光，提示 Matrigel基質中，不同層次的細胞基本存活，且生長狀態較好，細胞與材料具有良好的生物相容性，見圖3。

2.3 細胞增殖結果

實驗結果顯示，Matrigel三維培養體系中，隨著培養時間的延長，細胞量顯著增加，提示卵巢癌細胞在Matrigel基質中細胞活力較好，與倒置顯微鏡下觀察結果相一致，見圖4。

2.4 Matrigel中卵巢癌細胞相關因子的表達

實驗結果顯示在Matrigel三維培養體系中2株卵巢癌細胞均能分泌調控因子VEGFA、IGF1和EGF。與單層培養細胞比較，Matrigel三維培養下HO8910PM細胞 VEGFA、EGF的分泌量均明顯增高P＜0.05）；A2780細胞 VEGFA分泌量明顯增高（P＜0.05），見圖5。

3 討論

傳統的細胞培養法多采用玻璃或塑料的二維平面培養。實際上許多細胞從組織中分離并進行二維平面培養后，會逐漸平面化、異常分化甚至失去分化表型［5］。因此這種培養法不能真實地反映細胞在體內的生長情況。隨著科學技術的發展，人們逐漸認識到，細胞的生長、分化、增殖及凋亡等一系列生命活動受到細胞外微環境的影響［6-8］，這使得細胞培養技術得到不斷地改進。近年來，越來越多的研究表明三維培養比二維培養更能真實地反映細胞在體內的生物學行為［9］。然而，至今體外三維細胞培養技術還沒有公認的理想方法。

圖4 卵巢癌細胞在 Matrigel中的增殖密度

圖5 卵巢癌細胞二維及 Matrigel培養6 d相關因子的表達

細胞培養支架是影響體外三維培養的關鍵因素之一。目前用于腫瘤細胞三維培養的支架材料主要有多微孔支架及納米纖維支架。多微孔支架使用方便，但其孔徑（10～100 μm）遠大于細胞平均直徑（5～30 μm）。因此，附著于多微孔支架材料上的細胞實際上并沒有與材料充分接觸，培養細胞其實仍處于二維微環境中；而納米纖維支架雖能更好地模擬體外細胞生長的微環境，但其力學性能有時很難達到使用要求［10-12］。Matrigel是一種孔徑大約在20～50 nm的水凝膠基質，為 Kleinman等于1983年從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤組織中提取的一種細胞外基質蛋白，后來被命名為Matrigel，其主要成分為層黏連蛋白Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及巢蛋白，這與胚胎基底膜類似，因此可以促進多種細胞的分化［13］。此外，Matrigel還具有良好的成膠性及適宜的機械性能，在液態時可包裹細胞，固態時可形成交聯網絡，使大量細胞均勻分散黏附于其中，并能充分接觸到細胞基質，更好地模擬了體內細胞生長的微環境。

本研究結果表明，兩株細胞均勻分布于Matrigel基質中，呈近圓形，隨培養時間的延長可形成不規則狀細胞團，并能保持良好活性。此外，兩株卵巢癌細胞均能較好地分泌卵巢癌相關因子，與二維培養相比，兩株細胞VEGFA分泌量均明顯增高，HO8910PM細胞株中EGF分泌量也明顯增高。這些提示卵巢癌細胞在 Matrigel三維培養下能長時間保持其原有生物學特性。而在二維培養條件下，由于外在添加的可溶性因子通過充分混合、自由擴散便可快速均衡分布，細胞 24 h內就可以完全貼壁，呈多邊形，培養2～3 d細胞融合就可達 80％，但在培養第6天以后大部分細胞開始老化、脫落。這說明在二維培養體系中只能研究一些短暫動態的細胞行為變化。而觀察長期的、與形態變化相關的過程，則需要該培養體系中與細胞生長有關的效應分子能維持數小時甚至數天的時間。卵巢癌細胞置身于Matrigel三維微環境中，基質的結構特性如孔徑、纖維連接等均可減慢可溶性因子的擴散［14］，并長時間維持這種梯度分布的穩定性，有利于體外長時間觀察卵巢癌細胞形態變化相關的過程，也為體外卵巢癌耐藥性研究和細胞信號通路的研究提供了實驗基礎。

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Growth status of ovarian cancer cells in Matrigel three dimensional culture model

R737.31

A

1671-7783（2015）01-0014-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140289

國家自然科學基金資助項目（81160290）

蔡國徽（1992—），女，碩士研究生；宋鴻（通訊作者），博士，副教授，碩士研究生導師，E-mail:song-77@qq.com

2014-11-12 ［編輯］何承志