氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉致腸炎相關性結直腸癌小鼠模型的建立

張悅，田潔，田新宇，湯新逸，楊珺，耿麗娜，馬潔，許化溪，王勝軍（江蘇大學檢驗醫學研究所，江蘇 鎮江 212013）

氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉致腸炎相關性結直腸癌小鼠模型的建立

張悅，田潔，田新宇，湯新逸，楊珺，耿麗娜，馬潔，許化溪，王勝軍
（江蘇大學檢驗醫學研究所，江蘇 鎮江 212013）

目的：建立腸炎相關性結直腸癌的小鼠模型。方法：給予小鼠單次小劑量腹腔注射氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）聯合2％葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulpate，DSS）自由飲用，建立腸炎相關性結直腸癌小鼠模型。對照組小鼠給予 PBS腹腔注射后普通飲水。每天觀察癥狀，2％DSS 5 d，普通飲水16 d，此21 d為1個循環，共進行4個循環，結束后，斷頸處死小鼠，取脾臟、腸系膜淋巴結、結腸，觀察并比較兩組小鼠脾臟，腸系膜淋巴結大體改變和結腸 HE染色情況。結果：與對照組比較，實驗組小鼠脾臟、腸系膜淋巴結明顯增大，結腸遠端出現腫瘤。HE染色結果顯示，實驗組發病小鼠結腸黏膜層及黏膜下層出現廣泛的炎癥細胞浸潤，腺體組織結構紊亂、破壞，出現腺管樣結構，具有組織異型性。結論:單劑量 AOM與 DSS聯合使用可在短期內誘導小鼠結腸腫瘤的發生。

氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸鈉；結腸癌；動物模型

［Abstract］Objective:To establish a mice model of colitis associated cancer.Methods:The colitis associated cancer was induced by a single intraperitoneal injection of 12.5 mg/kg azoxymethane（AOM）and stepped by four cycles oral administration of 2％dextran sodium sulpate（DSS）.The occult blood was observed everyday.At the end of the fouth cycle，the mice were killed for observing the spleen，mesenteric lymph nodes，colon；colon tissues were harvested for mucosa morphological changes under light microscopy.Results:Compared to the control group，the spleens，mesenteric lymph nodes were enlarged and the tumorigenesis was found in distal colon in the experiment group；and there were a lot of inflammation cell infiltration and dysplasia in colon.Conclusion:Administration of AOM combined with DSS could induce a mice model of colorectal cancer in a short period.

［Key words］azoxymethane；dextran sodium sulpate；colorectal cancer；animal model

炎癥性腸病與結直腸癌密切相關［1］。雖然只有1％～2％直結腸癌患者是由炎癥性腸病發展而來，但炎性腸病遷延30年后超過18％的患者會發展為結直腸癌，是導致炎性腸病患者死亡的常見原因［2］。盡管近幾年結直腸癌的臨床研究有了較大的進展，但對于其發病機制仍不清楚，需要進一步深入研究，為此，建立合適的動物模型是必不可少的。氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）是一種用于建立嚙齒類動物模型常用的致癌劑，其作用機制主要為烷化 DNA造成堿基錯配進而導致癌癥的發生［3-4］；葡聚糖硫酸鈉 （dextran sodium sulpate，DSS）作為一種促炎藥物，溶解于小鼠的飲水中，可引發嚴重的以血性腹瀉為主要特征的腸炎［5］，長期反復接觸可發生慢性腸炎。本研究應用小劑量特異的結腸致癌劑 AOM聯合 DSS建立腸炎相關的結直腸癌小鼠模型，通過觀察相關癥狀和結腸病理切片來研究小鼠結直腸疾病的發展［6］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗小鼠 12只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，體質量 20克（揚州大學實驗動物比較中心）。動物合格證號:SCXR（蘇）2007-0001。

1.1.2 主要試劑 AOM購自美國 Sigma公司，DSS購自美國MP Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 12只實驗小鼠隨機均分為對照組（6只）和實驗組（6只）。實驗組腹腔注射12.5 mg/kg AOM并給予2％DSS水溶液自由飲用5 d；繼以普通飲水，16 d。此21 d為1個循環，共進行4個循環。對照組給予 PBS腹腔注射后普通飲水。造模中第27，48，69，90天為第1至第4個循環的最后一天。

1.2.2 結腸炎臨床觀察 整個實驗過程中每個循環的最后一天測體質量；2％DSS開始飲用時至飲用結束當天及開始普通飲水 7 d后，每天觀察是否存在肉眼可見血便，檢測糞便是否出現隱血。

1.2.3 病理檢查 在造模第4個循環結束后，小鼠斷頸處死，取脾臟及腸系膜淋巴結，分離肛門至回盲部連接處整段大腸。量取大腸長度，垂直剖開后生理鹽水沖洗。肉眼觀察后浸入10％甲醛緩沖液固定（pH=7.2）。常規脫水，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，讀片。

1.3 統計學方法

所有數據用 SPSS 11.5進行統計分析，兩組間均數比較采用獨立樣本 t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠糞便隱血及體質量的變化

實驗組小鼠于腹腔注射AOM后第1次飲用2％DSS水溶液后第 5天，67％（4/6）出現隱血或肉眼血便，在隨后正常飲水的第12天隱血癥狀消失；在第2，3，4個循環中飲用 2％DSS后分別有 67％ 4/6），50％（3/6），33％（2/6）小鼠出現隱血或肉眼血便。

在第1至第4個循環的最后一天（即第27，28，69，90天），稱量兩組小鼠體質量。結果顯示，實驗組小鼠體質量增加較對照組緩慢，平均體質量低于對照組。見圖1。

圖1 兩組小鼠體質量變化

2.2 小鼠結腸、脾臟及腸系膜淋巴結大體形態

與對照組比較，實驗組小鼠在結腸遠端可觀察到誘發的腫瘤，腸壁明顯變厚，脾臟及腸系膜淋巴結明顯腫大。見圖2。

圖2 兩組小鼠結腸、腸系膜淋巴結及脾臟大體形態

2.3 小鼠結腸組織學改變

對照組小鼠腺體排列整齊，實驗組 82％（5/6）小鼠結腸黏膜層及黏膜下層出現廣泛的炎癥細胞浸潤，癌組織侵入黏膜層，腺體組織結構紊亂、破壞，出現腺管樣結構，具有組織異型性。見圖3。

3 討論

圖3 兩組小鼠結腸組織 HE染色結果（×10）

嚙齒動物模型可模擬結直腸癌的多種特征，是研究結直腸癌的發生發展潛在機制的重要手段［6］；同時，也是研究臨床預試驗和新治療方法不可缺少的工具。AOM誘導出腫瘤的高發部位位于結腸遠端，與人類結直腸癌的發病特點相似。在此模型中，DSS起到促炎癥反應作用；嚙齒類動物飲用 DSS水溶液可產生腸上皮毒性，表現為以血性腹瀉為特征的腸炎。DSS的劑量選擇也是造模成功與否的關鍵因素之一，過高會導致小鼠在造模過程中大量死亡，而過低則無法誘導出腸癌。本實驗采用2％DSS對于結直腸癌模型的建立較為合適。

本研究給予小鼠單次小劑量腹腔注射 AOM聯合4個循環 2％DSS自由飲用建立潰瘍性結腸炎相關性大腸癌小鼠模型，共90 d，期間觀察小鼠相關癥狀的變化。實驗組小鼠與對照組小鼠相比，體質量增加緩慢，到了循環后期差距越來越明顯，此為實驗組小鼠發生早期的腸炎與后期所發展的腸癌帶來的后果。通過對小鼠在疾病發展過程中隱血及肉眼便血的動態觀察可以發現，實驗組小鼠前 2個循環中急性腸炎的癥狀突出，在第4個循環結束時，結腸遠端出現肉眼可見的腫瘤，呈典型的腺癌樣結構。雖然其他誘癌劑也可用于建立該模型，如二甲肼，但AOM具有溶解劑型的穩定性優勢，且誘導結腸癌的重復性好［7-8］。以 AOM聯用1個DSS循環可模擬急性腸炎誘發的腸癌［9-10］。而本研究中采用AOM聯用4個 DSS循環，由于 DSS的反復刺激造成慢性腸炎，故誘導出慢性腸炎相關性腸癌。AOM聯用4個DSS循環與聯用1個DSS循環相比，產生的腫瘤更高發，且腫瘤生長速度更快［9，11］。

綜上所述，本研究中AOM聯用 DSS誘導的腸炎相關性結直腸癌動物模型與人類結直腸癌在癥狀和病理變化上高度相似，且方法簡單，實驗動物易獲得，不僅可用于疾病發生機制的研究，還可用于臨床預防及治療的研究。

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Establishment of AOM/DSS induced a mice model of colitis associated cancer

ZHANG Yue，TIAN Jie，TIAN Xin-yu，TANG Xin-yi，YANG Jun，GENG Li-na，MA Jie，XU Hua-xi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

R735.3

A

1671-7783（2015）01-0019-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y140109

國家自然科學基金資助項目（31170849）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011472）

張悅（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail:sjwjs@ujs.edu.cn

2014-04-18 ［編輯］劉星星