IκBα顯性負相重組慢病毒載體的構建及其在 NF-κB信號通路中的功能驗證

路堯，嚴沁，盧春（南京醫科大學病原生物學系，江蘇 南京 210029）

IκBα顯性負相重組慢病毒載體的構建及其在 NF-κB信號通路中的功能驗證

路堯，嚴沁，盧春
（南京醫科大學病原生物學系，江蘇 南京 210029）

目的：構建表達 IκBα顯性負相結構（dominant-negative construct，IκBα-DN）的重組慢病毒載體，并檢測其對核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路的影響。方法：PCR擴增 IκBα-DN片段并插入至 pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP載體中。將構建的 pCDH-IκBα-DN重組質粒與包裝質粒 psPAX2和包膜質粒 pMD2.G共同轉染 293 T細胞，包裝表達 IκBα-DN的重組慢病毒，并用梯度稀釋法檢測病毒滴度。以慢病毒 IκBα-DN感染 293 T細胞，通過免疫印跡檢測IκBα蛋白的表達量。將慢病毒 IκBα-DN感染已轉染有 NF-κB蟲熒光素酶報告質粒的 293 T細胞，24 h后檢測 IκBα-DN對 NF-κB活性的影響。進一步用慢病毒 IκBα-DN感染表達卡波氏肉瘤病毒（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）的人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），以檢測 IκBα-DN在 NF-κB信號通路中的功能。結果：限制性內切酶鑒定以及核酸序列比對證實重組質粒 pCDH-IκBα-DN構建成功。通過三質粒包裝系統包裝表達 IκBα-DN的重組慢病毒，病毒滴度約為 3×107efu/mL。以慢病毒 IκBα-DN感染 293 T細胞，免疫印跡結果表明胞質中 IκBα蛋白的表達量明顯升高。蟲熒光素酶報告實驗結果提示，重組慢病毒介導的 IκBα-DN能有效抑制 NF-κB的活性。在表達KSHV vFLIP的 HUVECs中，IκBα-DN也能顯著減弱 NF-κB通路信號。結論:成功構建的含IκBα-DN序列的慢病毒能夠有效地感染293 T細胞和內皮細胞，且初步結果提示 IκBα-DN能增加胞質內 IκBα的含量，并進一步抑制 NF-κB信號的傳遞。

核轉錄因子-κB；IκBα；顯性負相結構；慢病毒；卡波氏肉瘤病毒

［Abstract］Objective:To construct the recombinant lentivirus carrying the dominant-negative construct of IκBα（IκBα-DN），and identify the role in NF-κB signaling pathway.Methods:The fragment of IκBα-DN sequence from expression vector pMIGR1-IκBα-DN was cloned into the lentivirus vector pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP.The recombinant plasmid pCDH-IκBα-DN，packaging vector psPAX2 and envelope vector pMD2.G were co-transfected into 293 T cells.The transfection efficiency was determined by observing the expression of green fluorescent protein（GFP）.The total of 293 T cells were transduced with Lentivirus-IκBα-DN in the same multiplicity of infection（MOI）and IκBα protein was detected by Western blot. Next，Lentivirus-IκBα-DN was transduced into 293 T cells transfected with NF-κB luciferase reporter plasmid before and then the activity of NF-κB was detected.Similarly，human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）expressing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）encoding viral FLICE inhibitory protein（vFLIP）were infected with Lentivirus-IκBα-DN and the expression of IκBα protein was determined by Western blot.Results:The recombinant plasmid pCDH-IκBα-DN and the recombinant lentivirus carry-ing IκBα-DN were constructed successfully in succession.The titer of Lentivirus-IκBα-DN was 3×107efu/ mL.The expression of cytoplasmic IκBα protein in 293 T cells infected by Lentivirus-IκBα-DN was significantly increased.Further，the result of luciferase reporter assay indicated that Lentivirus-IκBα-DN inhibited the activity of NF-κB.The same result was found in HUVECs expressing vFLIP and infected by Lentivirus-IκBα-DN.Conclusion:The recombinant lentivirus containing IκBα-DN was successfully constructed，and was able to infect 293 T cells and HUVECs effectively.Our date indicated that IκBα-DN could increase the content of IκBα in cytoplasm，and further inhibit NF-κB signaling.

［Key words］NF-κB；IκBα；dominant-negative construct；recombinant lentivirus；Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus

核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的抑制性蛋白（inhibitor kappa B，IκB）家族包括8個成員，分別是p100、p105、IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3和 IκB-R［1］。NF-κB以 p50/p65異二聚體形式普遍存在于細胞質中，與 IκBα結合而呈失活狀態［2］。經多種刺激劑激活，IκBα被磷酸化與降解，使得NF-κB與 IκBα解離轉位進入細胞核，并與靶基因啟動子或增強子上的 κB位點結合，通過調節多種靶基因的表達參與調控細胞存活、增殖、分化以及血管生成等許多重要的生物學過程［3-6］。

卡波氏肉瘤病毒 （Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）是一種 γ2型皰疹病毒［7］，是卡波氏肉瘤（Kaposi's sarcoma，KS）的病原體［8］。KS以血管異常增生為主要特征，常發于皮膚并可累及黏膜淋巴結和內臟器官［9］。KSHV編碼的多種蛋白具有致瘤效應，如 K2基因編碼的病毒白細胞介素6 （viral interleukin-6，vIL-6）、K9基因編碼的病毒干擾素調節因子1（viral interferon regulatory factor 1，vIRF-1）以及 K13基因編碼的病毒 Fas相關死亡結構域介素-1β轉換酶抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）等［9-10］。其中致瘤蛋白 vFLIP在潛伏期表達［10］，可與 IκB激酶復合物（inhibitor of kappa B kinase complex，IKK）相互作用并激活 NF-κB信 號 通 路［11-13］。為 研 究 NF-κB信 號 通 路 在vFLIP致瘤過程中的作用，本實驗構建了能夠抑制IκBα磷酸化并阻止 NF-κB入核發揮轉錄因子功能的IκBα顯性負相結構（dominant-negative construct，IκBα-DN）重組慢病毒載體，從而為闡明 KSHV的感染和致瘤機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞

本實驗中所用的慢病毒包裝系統由3種質粒構成，分別為包裝質粒 psPAX2、包膜質粒 pMD2.G以及慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP。真核表達質粒 pMIGR1-IκBα-DN，蟲熒光素酶報告實驗中所用NF-κB蟲熒光素酶報告質粒與內參質粒pRL-TK為本實驗室保存。實驗中所用人胚腎上皮細胞（293 T細胞）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）均在37℃、5％ CO2的培養箱中培養，分別生長于含有10％和20％滅活胎牛血清（美國 Gibco公司產品）的 DMEM中（美國Hyclone公司產品），培養基中加入慶大霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）。

1.2 試劑

實驗中的 PCR引物由蘇州金唯智科技有限公司合成；PCR酶購自南京諾唯贊科技有限公司；質粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒為美國Omega公司產品；DNA連接酶與質粒轉染試劑 LipofectamineTM2000分別購自美國Thermo公司和Invitrogen公司；抗 IκBα單克隆抗體與抗 Flag M2單克隆抗體均為美國Cell Signaling公司產品；抗α-微管蛋白單克隆抗體購自美國 Santa Cruz公司；Dual-Glo Luciferase Assay System為美國Promega公司產品。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增 IκBα-DN序列 根據真核表達質粒 pMIGR1-IκBα-DN分別設計 IκBα-DN序列的上下游引物，其中上游引物為5′-TTGAATTCGCCACCATGTTTCAGCCAGCTGGGCAC-3′（下劃線部分為EcoR I識 別 序列），下 游引物為5′-CGGGATCCTTATTTGTCATCGTCGTCCTTATAATCCTTATCGTCATCATCCTTGTAATCTTTGTCGTCGTCATCCTTGTAGTCTAATGTCAGACGCTGGCCTCC-3′（下劃線部分為BamH I識別序列，斜體部分為標簽蛋白 Flag序列）。以 pMIGR1-IκBα-DN質粒為模板，通過上述上下游引物PCR擴增出IκBα-DN序列，經核酸電泳檢測 PCR產物并切膠回收。

1.3.2 重組質粒pCDH-IκBα-DN的構建及鑒定

用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ同時酶切PCR回收產物與慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，將純化后的雙酶切產物用 T4連接酶連接過夜。取連接產物轉化入感受態大腸埃希菌DH5α，挑選氨芐西林抗性菌落進行擴增，通過質粒小提試劑盒提取出重組質粒 pCDH-IκBα-DN。對獲得的重組質粒進行雙酶切鑒定，同時送蘇州金唯智科技有限公司進行核酸序列測定。

1.3.3 重組慢病毒Lv-IκBα-DN的包裝與滴度測定

利用LipofectamineTM2000將構建成功的重組質粒pCDH-IκBα-DN與包 裝質 粒 psPAX2、包膜 質 粒pMD2.G共同轉染入 293 T細胞，轉染10 h后更換新鮮培養基繼續培養［14］。終止轉染 48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達。收取細胞培養上清并經0.45 μm濾器過濾，將包裝的重組慢病毒及其對照慢病毒分別命名為Lv-IκBα-DN和Lv-Mock。將病毒液進行梯度稀釋，分別感染提前24 h鋪板的293 T細胞。通過熒光計數法測定兩者滴度。

1.3.4 重組慢病毒介導的 IκBα-DN在 293 T細胞中的表達 將293 T細胞鋪入 6孔板中，24 h后以相同感染復數的 Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock病毒液分別感染。感染48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，同時提取蛋白進行免疫印跡，檢測 IκBα蛋白的表達情況。

1.3.5 重組慢病毒介導的 IκBα-DN在 HUVECs中的表達 依照“1.3.4”中的步驟感染HUVECs，48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，同時提取蛋白進行免疫印跡，檢測IκBα蛋白的表達情況。

1.3.6 蟲熒光素酶報告實驗檢測 IκBα-DN對 NF-κB活性的影響 提前24 h將293 T細胞鋪入48孔板中，利用 LipofectamineTM2000共同轉染入 NF-κB蟲熒光素酶報告質粒以及內參質粒pRL-TK。轉染24 h后依照“1.3.4”中的步驟感染 24 h。收集細胞，按照 Dual-Glo Luciferase Assay System說明書中推薦步驟檢測熒光素酶活性。

1.4 統計學方法

使用統計學軟件 SPSS 19.0對數據進行標準差統計，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IκBα-DN序列的PCR擴增

以真核表達質粒 pMIGR1-IκBα-DN為模板進行PCR擴增，PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約1 039 bp位置出現與預期一致的 IκBα-DN片段（圖1）。

圖1 PCR擴增IκBα-DN序列

2.2 重組質粒pCDH-IκBα-DN的鑒定

對構建的重組質粒pCDH-IκBα-DN進行酶切鑒定，酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后分別產生 2條片段，大小約7 742 bp和1 039 bp，即代表慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和 IκBα-DN序列（圖 2）。測序結果表明，全長為1 039 bp的外源基因已克隆至慢病毒載體中。DNAssist軟件比對結果證實，插入的IκBα-DN片段與pMIGR1-IκBα-DN中的序列一致，引入的 Flag序列完全正確，表明重組質粒pCDH-IκBα-DN構建成功。

圖2 重組質粒 pCDH-IκBα-DN的酶切鑒定

2.3 重組慢病毒的包裝與滴度測定

用LipofectamineTM2000轉染試劑將包裝質粒、包膜質粒與IκBα-DN重組質粒共轉染入 293 T細胞，48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到大約 80％293 T細胞表達綠色熒光（圖3）。分別收取重組慢病毒Lv-IκBα-DN以及對照慢病毒Lv-Mock的病毒液，過濾后感染 293 T細胞，48 h后通過熒光計數法測得Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock的滴度分別為 3×107efu/ mL和2×107efu/mL。

2.4 重組慢病毒 Lv-IκBα-DN在293 T細胞中的表達驗證

將Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock病毒液分別感染293 T細胞，48 h后在熒光顯微鏡可觀察到約 90％細胞表達綠色熒光。同時收取細胞蛋白進行免疫印跡，利用抗Flag M2單克隆抗體可在39×103處檢測到特異性條帶，且 IκBα蛋白表達水平上升，說明重組慢病毒Lv-IκBα-DN和 Lv-Mock包裝成功，IκBα-DN能夠增加胞質內 IκBα蛋白的表達。見圖4。

圖3 三種質粒共轉染293 T細胞后的綠色熒光蛋白的表達（×100）

圖4重組慢病毒介導的 IκBα-DN在 293 T細胞中的表達

2.5 蟲熒光素酶報告實驗檢測 IκBα-DN對 NF-κB活性的影響

將NF-κB蟲熒光素酶報告質粒與內參質粒pRL-TK共同轉染入293 T細胞，并以Lv-IκBα-DN 和Lv-Mock病毒液分別進行感染，24 h后檢測熒光素酶活性。結果顯示，IκBα-DN顯著抑制了 NF-κB報告質粒的活性，差異有統計學意義（P＜0.000 1）。見圖5。

圖 5 蟲熒光素酶報告實驗檢測 IκBα-DN對NF-κB活性的影響

2.6 重組慢病毒 Lv-IκBα-DN在 HUVECs中的功能驗證

用Lv-IκBα-DN和Lv-Mock病毒液分別感染穩定表達 KSHV vFLIP的 HUVECs（vFLIP）及其對照細胞（Mock），最終獲得 Mock-pCDH、Mock-IκBα-DN、vFLIP-pCDH、vFLIP-IκBα-DN四株細胞株。免疫印跡檢測發現，經重組慢病毒導入IκBα-DN序列后，被vFLIP所抑制的胞質內 IκBα蛋白的表達明顯升高（圖6），證明IκBα-DN在HUVECs中可以得到有效表達，并且能夠在穩定表達 KSHV vFLIP的細胞中發揮抑制 NF-κB信號通路的作用。

圖6 重組慢病毒介導的 IκBα-DN在 HUVECs中的功能驗證

3 討論

NF-κB信號通路在抵御病原微生物的天然免疫系統中起著重要的作用，而很多病原微生物也在不斷地進化中形成了調控 NF-κB信號通路的應對策略。其中，KSHV的生命周期和致病過程被證實與NF-κB信號通路密切相關。KSHV是一種可以導致多種惡性腫瘤發生的病毒，NF-κB信號通路的過度激活可導致 NF-κB靶基因的異常表達，這些基因往往與腫瘤的發生、轉移、組織浸潤以及腫瘤細胞的抗凋亡作用相關，如調控細胞增殖的細胞周期蛋白 D1和細胞周期蛋白 E，與炎癥反應和血管生成相關的白細胞介素1、白細胞介素6、血管內皮生長因子、細胞間黏附分子-1和內皮細胞選擇素，以及與遷移侵襲相關的尿激酶、基質金屬蛋白酶2/9和細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）。

目前研究表明，KSHV編碼的多種蛋白參與調節 NF-κB信號通路，如 vFLIP、vGPCR、K1、vIRF3、FGARAT、K15、RTA［15］。其中，KSHV潛伏期蛋白vFLIP通過與NEMO綁定促進胞質內IKK復合物的形成，進而激活 NF-κB信號通路［16］。除此之外，KSHV vFLIP激活 NF-κB信號通路還需要上調宿主細胞環氧化酶2的表達［17］。另有研究表明，在KSHV感染的細胞中，被 vFLIP激活的 NF-κB進入細胞核后除了調節細胞的存活、增殖及血管形成等生物學過程，同時也增強了鋅指蛋白A20的表達，表達量增加的 A20則可抑制 NF-κB通路信號，從而形成了對 NF-κB信號通路的負反饋調節［18］。在經典的NF-κB信號通路中，IκBα也是典型的能夠發揮抑制NF-κB入核作用的關鍵蛋白。IκBα可以通過C端含有的3～8個錨蛋白基序，覆蓋NF-κB的核定位序列，從而達到抑制NF-κB活性的目的［19-21］。

因此，許多研究中都采用 IκBα磷酸化的抑制劑來阻斷NF-κB信號通路，以滿足各自的研究需要。目前比較常用的為（E）-3-（對甲苯磺酰基）丙烯腈，是一種高效的化學抑制劑，能夠不可逆地抑制IκBα的磷酸化反應，從而阻止了 NF-κB的入核。這種化學抑制劑優點是效率高，但有明顯的細胞毒性作用，會影響細胞的正常生長，繼而會對隨后的表型實驗產生干擾。因此，本課題組構建了IκBα顯性負相結構的重組慢病毒載體，它以慢病毒的方式導入細胞并穩定表達，既能夠成功地抑制IκBα的磷酸化又不會對細胞產生毒副作用。這種方法目前已經比較成熟，已有研究者利用IκBα-DN成功使得胰腺癌 PC-3細胞株中 NF-κB低表達［22］，此外國外實驗室為研究 NF-κB信號通路調節乳腺癌細胞向肺部轉移過程中的免疫和炎癥反應過程，就應用了IκBα-DN這一技術并取得了很好的結果［23］。

本實驗室在前期研究中將vFLIP基因通過慢病毒載體的形式整合入HUVECs，穩定表達的vFLIP蛋白通過活化的IKK復合物泛素化、磷酸化并最終降解IκBα，從而使 NF-κB大量進入細胞核，啟動與腫瘤形成相關基因的表達［24］。目前本實驗室已經通過同位素標記相對和絕對定量蛋白組學技術，對穩定表達 vFLIP的內皮細胞及其對照細胞株進行了蛋白表達譜的測定，并篩選出部分與腫瘤形成有關的蛋白。vFLIP可能通過 NF-κB信號通路調控其中某些關鍵蛋白的表達，從而參與 KSHV的致瘤過程。為了進一步驗證 NF-κB信號通路及其下游的關鍵靶基因在其中的重要作用，本實驗構建了表達IκBα-DN的重組慢病毒載體，以抑制 IκBα的磷酸化與降解，從而抑制NF-κB信號的活化。在后續研究中，構建的IκBα-DN重組慢病毒載體將應用于逆轉vFLIP對NF-κB信號通路的激活作用，有助于檢驗所篩選出的關鍵蛋白是否參與了 vFLIP通過調控NF-κB信號通路促進腫瘤生成的過程，從而為進一步闡明KSHV相關惡性腫瘤的發病機制奠定實驗基礎。

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Construction of recombinant expression lentivirus vector carrying IκBα-DN and identification of its role in NF-κB signaling pathway

LU Yao，YAN Qin，LU Chun
（Department of Microbiology，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

R393

A

1671-7783（2015）01-0027-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y140327

路堯（1986—），男，碩士研究生；盧春（通訊作者），教授，碩士生導師，E-mail:clu@njmu.edu.cn

2014-08-27 ［編輯］何承志