食品及生物樣品中牛磺酸分析方法研究進(jìn)展

王曉鶯

摘 要： 隨著分析方法學(xué)及生理學(xué)研究的日益深入，牛磺酸的分析方法研究有了一定的發(fā)展。本文綜述了近年來(lái)牛磺酸分析方法的研究進(jìn)展，從薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法三個(gè)方面介紹了有關(guān)牛磺酸分析方法的基本特點(diǎn)和應(yīng)用實(shí)例，比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，旨在為牛磺酸食品、藥品的研究、開(kāi)發(fā)、應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞： 牛磺酸 分析方法 薄層色譜法 氣相色譜法 高效液相色譜法

1.引言

牛磺酸（taurine）是在1827年首次由Tidman和Gmelin從牛膽汁中分離出來(lái)的一種酸，又稱牛膽堿、牛膽素。其化學(xué)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，分子式為H■N-CH■-CH■SO■H，易溶于水，微溶于95%乙醇，加熱至300℃分解。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫、避光、密閉、干燥的條件下可保存3年。

牛磺酸是一種有著廣泛生理功能的氨基酸，對(duì)生命的基本過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用，被廣泛應(yīng)用于藥品或食品領(lǐng)域。如何準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地測(cè)定各牛磺酸制品中牛磺酸的含量，日益成為大家關(guān)注的問(wèn)題，以下筆者將對(duì)牛磺酸的分析方法研究進(jìn)展加以綜述。

2.分析方法

關(guān)于牛磺酸的分析方法報(bào)道比較多。目前常用的檢測(cè)方法是薄層色譜法、氣相色譜法及高效液相色譜法等。

2.1薄層色譜法

薄層色譜法是目前常用的鑒別及測(cè)定牛磺酸的方法。周紅梅等以硅膠G為固定相，以正丁醇-無(wú)水乙醇-水-冰醋酸（3∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，用茚三酮的乙醇溶液顯色，建立了復(fù)方尿維氨滴眼液中牛磺酸有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)方法為：使用正丁醇-無(wú)水乙醇-水-冰醋酸=3∶1∶1∶1（體積比）為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)5h。茚三酮乙醇溶液顯色劑噴霧后置110℃烘箱中加熱10min。顯色后斑點(diǎn)用紫外分光光度法檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此色譜條件下，牛磺酸可與其他生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物有效分離。

使用薄層色譜法，操作簡(jiǎn)便，不需特殊試劑和昂貴儀器，適宜在基層單位推廣、使用，并可使樣品中牛磺酸與雜質(zhì)得到較好地分離。但本法靈敏度較低、屬于半定量的方法，而且薄層厚度、點(diǎn)樣技術(shù)及展開(kāi)的條件難以保持恒定，從而影響定量的準(zhǔn)確性。

2.2氣相色譜法

氣相色譜法作為測(cè)定氨基酸及牛磺酸含量的方法在國(guó)內(nèi)外得到較廣泛的應(yīng)用。Chorvat等與Motoki Matsuda等使用相同的氨基衍生化試劑，僅在衍生化過(guò)程中做了較小改動(dòng)，先后建立了氣相色譜-質(zhì)譜（GC-EI-MS）測(cè)定樣品中牛磺酸含量的方法。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，食品等樣品中有85%的牛磺酸是以游離形式存在的。

氣相色譜法在靈敏度及準(zhǔn)確度等方面都能達(dá)到檢測(cè)要求，但是在樣品前處理等方面要求較高，而且氣相色譜昂貴的價(jià)格使其不宜推廣使用。

2.3高效液相色譜法

高效液相色譜法在測(cè)定樣品中牛磺酸的含量時(shí)，具有樣品前處理方法簡(jiǎn)單、靈敏度和準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點(diǎn)，故更被廣泛應(yīng)用。與許多氨基酸一樣，牛磺酸需要對(duì)其進(jìn)行衍生化反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道的用于反相高效液相色譜法測(cè)定牛磺酸的衍生化試劑主要有：鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、4-二甲胺基偶氮苯-4’-磺酰氯（DABS-Cl）等。下面對(duì)目前常用的測(cè)定牛磺酸使用的衍生化試劑進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

2.3.1鄰苯二甲醛（OPA）

鄰苯二甲醛（OPA）是目前柱前衍生測(cè)定牛磺酸應(yīng)用最廣泛的試劑之一，國(guó)外有研究者研究了OPA作為衍生化試劑分析氨基酸的方法。國(guó)標(biāo)（2003版）規(guī)定的測(cè)定牛磺酸的標(biāo)準(zhǔn)方法之一是用OPA（鄰苯二醛）做柱前衍生試劑，高液相色譜法測(cè)定食品中的牛磺酸。具體做法是：吸取2.5ml樣品提取液于5ml具塞離心管中，準(zhǔn)確加入等量的衍生劑，搖勻，反應(yīng)2min后，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)慮，立即進(jìn)樣20μl，測(cè)定其峰面積。所有試樣及標(biāo)準(zhǔn)溶液從反應(yīng)至進(jìn)樣的時(shí)間應(yīng)保持一致，并控制在5min內(nèi)，以保留時(shí)間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。由于衍生化試劑對(duì)衍生反應(yīng)的速度及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性均有比較大的影響，故Toshiaki Momose等研究了OPA在線衍生測(cè)定食品中牛磺酸的方法，使得分析結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

鄰苯二甲醛（OPA）作為最常用HPLC法測(cè)定牛磺酸的柱前衍生試劑，其在使用過(guò)程中表現(xiàn)出許多優(yōu)點(diǎn)，如①OPA本身不干擾分離與檢測(cè)，不必除去過(guò)量試劑。②反應(yīng)迅速，可實(shí)現(xiàn)在線衍生化反應(yīng)，提高工作效率。但其在應(yīng)用中存在一些問(wèn)題，主要表現(xiàn)在：①OPA衍生產(chǎn)物很不穩(wěn)定，需要嚴(yán)格控制衍生化反應(yīng)時(shí)間及進(jìn)樣時(shí)間（各樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化反應(yīng)時(shí)間及進(jìn)樣時(shí)間要嚴(yán)格保持一致，并控制在5min內(nèi)），否則將嚴(yán)重影響準(zhǔn)確度及精密度，對(duì)操作要求比較高。②需在衍生試劑中另外加入乙硫醇共同反應(yīng)，而乙硫醇?xì)馕洞瘫牵矣斜容^大的毒性。

2.3.2丹磺酰氯（Dansyl-Cl）

近年來(lái)，常見(jiàn)用丹磺酰氯（Dansyl-Cl）作為HPLC法測(cè)定生物樣品中的牛磺酸的柱前衍生試劑的報(bào)道。丹磺酰氯-牛磺酸復(fù)合物具有顯著的熒光特性，并且性質(zhì)穩(wěn)定，這使其優(yōu)于其他許多衍生化試劑。但是，此反應(yīng)亦有其不足之處，如需加入熒光猝滅劑中止反應(yīng)、較高的反應(yīng)溫度及較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間等。

Amiss等證實(shí)了丹磺酰氯（Dansyl-Cl）適宜用于貓科動(dòng)物的血漿及全血的光譜學(xué)分析。基于Amiss等的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，SanjeewaGamagedara等研究者建立了尿液中牛磺酸的高效液相色譜測(cè)定方法。

2.3.34-二甲胺基偶氮苯-4’-磺酰氯（DABS-Cl）

DABS-Cl以其高靈敏度、較強(qiáng)的可靠性及良好的重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)被用于牛磺酸的柱前衍生劑。

Stocchi等應(yīng)用梯度洗脫程序建立了人血清中牛磺酸的高效液相色譜分析方法，方法的靈敏度達(dá)到pmol級(jí)。具體做法是：取10μl血清樣品，用0.5ml高氯酸（5%）萃取或用CF50的濾膜過(guò)濾，萃取液或?yàn)V液與40μl DABS-Cl（4nmol/μl的乙腈溶液，臨用新配）在10μl碳酸氫鈉（0.1mol/L，pH=9）存在的條件下，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為10min。衍生產(chǎn)物在C18柱上得到良好分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為436nm。

綜上，高效液相色譜法是目前測(cè)定食品特別是生物樣品中牛磺酸最常用的方法。雖然牛磺酸缺乏紫外吸收基團(tuán)而使其必須經(jīng)過(guò)較復(fù)雜的衍生化反應(yīng)方可進(jìn)行測(cè)定，但由于高效液相色譜法較高的靈敏度、可靠性及相對(duì)較短的分析時(shí)間，仍然使其成為測(cè)定牛磺酸最常采納的方法。

3.展望

近年來(lái)，人們正以極大興趣不斷深入研究這一結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易獲得、幾乎無(wú)毒、應(yīng)用廣泛的化合物，而且不斷擴(kuò)大其在醫(yī)藥及衛(wèi)生領(lǐng)域中的應(yīng)用。但是，對(duì)于牛磺酸的研究還存在許多未知領(lǐng)域，還需要進(jìn)一步探索，以便更全面深入地認(rèn)識(shí)牛磺酸，為人類所利用，相信不久的將來(lái)對(duì)牛磺酸的研究將出現(xiàn)新的飛躍。