左歸丸對老年大鼠CD4+T細胞IL-2基因啟動子區域甲基化的影響

龔張斌 徐品初 韓志芬 金國琴 (上海中醫藥大學基礎醫學院生化教研室，上海 20203)

T細胞功能紊亂是免疫衰老過程中最顯著的變化之一。衰老機體細胞免疫功能衰退，主要表現為白細胞介素(IL)-2基因表達下降，出現繼發性免疫缺陷，感染性疾病、腫瘤等的罹患率和死亡率大幅升高〔1〕。研究發現在IL-2基因轉錄起始點附近包含有多個CpG結構，它們的甲基化水平對IL-2基因的表達具有重要調節作用〔2〕。本實驗通過觀察自然衰老“腎虛”大鼠模型IL-2基因啟動子區域CpG位點甲基化水平的變化，探討左歸丸對IL-2轉錄表觀遺傳修飾調控的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，清潔級，上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(滬)2008-0016。飼養條件:群養，2 只/籠，溫度 18℃ ～22℃，光暗周期 12 h∶12 h。采用組間比較法隨機分組:① 青年對照組:6月齡;② 老年對照組:23月齡;③老年左歸丸組(簡稱老年左歸組):23月齡。老年左歸組從20月齡起以飲料方式飼喂左歸藥液，連續3個月，各鼠用藥劑量為0.5 g生藥/100 g體質量，約為臨床成人每千克體質量劑量的10倍。青年對照組、老年對照組給予正常飲水和飼料。

1.1.2 主要藥物和試劑 左歸丸:按照《景岳全書卷五十一·新方八陣》原方進行配制，熟地24 g、山藥12 g、枸杞12 g、山茱萸 12 g、川牛膝9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、龜膠12 g，購自上海康橋藥業有限公司。除鹿角膠、龜膠外，其余成分按原方比例水煎2次，濃縮成劑，將鹿角膠、龜膠烊化，混合此三種藥液，濃縮成膏，濃度2.92 g生藥/g煎膏，－30℃保存。

FITC-抗CD4，兔抗大鼠 CD3、CD28單克隆抗體等購自Ebioscience公司。DNA甲基轉移酶(DNMTs)活性檢測試劑盒購自Epiquik公司。PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 ABI SETPONE PLUS型熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Inc.;BD FACSAria型流式細胞儀，BD Biosciences公司;Biotek酶標儀，Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀分選CD4+T細胞 大鼠腹腔麻醉，無菌條件下取脾臟，冰上研磨得單細胞懸液，應用大鼠淋巴細胞分層液分離淋巴細胞，抗-CD4-FITC染色，4℃ 30 min，避光。應用流式細胞儀進行CD4+T細胞的分選。細胞純度＞95%，活細胞＞90%。

1.2.2 抗CD3/抗CD28聯合刺激CD4+T細胞 分選得到的細胞隨機進行刺激處理或無刺激處理。刺激處理:預先以5 μg/ml抗-CD3單抗包被24孔培養板。各組CD4+T細胞用含10%(體積化)熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640溶液調整細胞密度為2×106/ml，加入24孔培養板中，同時加入200 U/ml的青霉素和 100 μg/ml的鏈霉素，2 μg/ml抗-CD28 單抗，置于含5%CO2、100%濕度、37℃培養箱中，進行體外刺激培養。分別在4、24 h收集細胞。無刺激處理細胞用含10%FBS，200 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640溶液在同樣條件下培養。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 Q Real time PCR法檢測IL-2基因mRNA表達 Trizol Reagent抽提各組各時間點CD4+T細胞的總RNA。合成cDNA，采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，進行q RT-PCR反應。反應體系:2 ×SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μl，正、反義引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 × ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μl，反轉錄產物 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混勻，加入 PCR 管中。擴增條件:95℃變性30 s;95℃ 5 s，61℃ 退火31 s，共40個循環;95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每組待測樣本均設立六個重復，全部反應結束之后，mRNA的變化值按公式:2-△△Ct〔△△Ct=樣本△Ct－陰性對照Ct〕進行計算。引物如下:IL-2:正義 agcgtgtgttggatttgactc，反義 atgatgctttgacagatggcta;β-actin:正義:cacccgcgagtacaaccttc，反義:cccatacccaccatcacacc。

1.2.3.2 ELISA法檢測CD4+T細胞DNMTs活性 按照Epiquik試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 特異性甲基化PCR(MSP)法檢測CD4+T細胞IL-2基因啟動子區域各CpG位點的甲基化程度 Qiagen DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA(gDNA)。應用GenomiPhi DNA Amplification試劑盒(Amersham Bioscience)制備陰性對照(全部CpG位點均為非甲基化)。應用CpG methyltransferase試劑盒(New England BioLab)制備陽性對照(全部CpG位點均為甲基化)。Qiagen methylation-Gold試劑盒處理gDNA，將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不變。以處理后的gDNA為模板進行q RT-PCR反應。反應體系為:2×SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ10 μl，正、反義引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 ×ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，gDNA 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混勻，加入 PCR管中。擴增條件:95℃變性 30 s;95℃5 s，61℃ 退火 31 s，共 40 個循環;95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。每組待測樣本均設立六個重復。按照以下公式進行計算:2－CtM/(2－CtM+2－CtU)×100%。引物如下:Set1甲基化正義5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTCGTCGT-3'，反義 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACGCC-3';Set1非甲基化正義5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTTGTTGT-3'，反義 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACACC-3'。Set2甲基化正義5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTC-3'，反義 5'-AAATACACCAAATTCCTCG-3';Set2非甲基化正義5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTT-3'，反義 5'-AAATACACCAAATTCCTCA-3'。β-actin正義5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，反義5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 結果

2.1 各組大鼠CD4+T細胞中IL-2 mRNA的表達情況 抗-CD3聯合抗-CD28刺激4 h后，IL-2 mRNA開始表達，但各組間無明顯差異(P＞0.05)。抗-CD3聯合抗-CD28刺激24 h后，與青年對照組比較，老年對照組CD4+T細胞IL-2 mRNA表達顯著降低(P＜0.01);與老年對照組比較，老年左歸組IL-2 mRNA表達顯著升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠CD4+T細胞經刺激后IL-2 mRNA表達的變化(±s，n=6，%)

表1 各組大鼠CD4+T細胞經刺激后IL-2 mRNA表達的變化(±s，n=6，%)

與青年對照組比較:1)P＜0.01;與老年組比較:2)P＜0.05;下表同

0 h 4 h 24 h青年對照組組別1.576±0.0588.654±1.2380.664±9.74老年對照組 1.492±0.10710.488±1.3038.673±5.611)老年左歸組 1.271±0.0999.898±1.5747.997±8.572)

2.2 各組大鼠CD4+T細胞中DNMTs的活性變化 與青年對照組(2.534±0.29)比較，老年對照組CD4+T細胞DNMTs活性(6.342±0.33)顯著升高(P＜0.01)。與老年對照組比較，老年左歸組DNMTs活性(5.633±0.12)明顯降低(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠CD4+T細胞刺激后IL-2啟動子區域CpG位點的甲基化程度變化 見表2。抗-CD3聯合抗-CD28刺激24 h后，IL-2基因轉錄起始位點(TSS)上游Set1區域:與青年對照組比較，老年對照組CpG位點甲基化程度顯著升高(P＜0.01);與老年對照組比較，老年左歸組CpG位點甲基化程度明顯降低(P＜0.05)。Set2區域:各組間CpG位點甲基化水平均無統計學差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠CD4+T細胞刺激24 h后IL-2啟動子CpG位點甲基化水平的變化(±s，n=6，%)

表2 各組大鼠CD4+T細胞刺激24 h后IL-2啟動子CpG位點甲基化水平的變化(±s，n=6，%)

甲基化水平青年對照組組別 Set1甲基化水平 Set226.795±5.4294.277±3.82老年對照組 61.488±5.101) 93.533±3.65老年左歸組 54.625±4.472)93.755±4.09

3 討論

IL-2是調控CD4+T細胞分化平衡狀態的關鍵因子之一。本實驗結果顯示，IL-2基因的轉錄水平呈現增齡性下降的特征，與其他報道一致〔3〕。

IL-2僅在活化的T細胞中表達，揭示其轉錄受到表觀遺傳修飾的調控〔4〕。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，染色質重塑，組蛋白修飾，microRNA調控等多種機制，其中DNA甲基化研究較為深入〔5〕。IL-2基因轉錄起始點附近+98～－2.2 kb區間包含多個CpG結構，其甲基化水平直接決定IL-2基因的表達與否〔6〕。DNMTs促進CpG甲基化，有實驗發現，如果應用甲基化酶抑制劑處理T細胞，IL-2分泌增多〔7〕。而應用抗CD3/抗CD28共刺激后發現多個CpG位點出現去甲基化，進而激活IL-2基因轉錄〔8〕。我們應用methprimer軟件對IL-2啟動子區域進行甲基化引物的設計，將該啟動子區分為兩個區域(Set1，Set2)，其中 Set1區域包括 TSS上游四個 CpG(－306，－434，－544，－547)位點，Set2包括 TSS上游兩個 CpG(－995，－1263)位點。實驗發現，在未刺激時，Set1，Set2區域的CpG位點均呈現高度甲基化，此時IL-2基因表達沉默。當CD4+T細胞受anti-CD3/anti-CD28刺激24 h后，Set1區域CpG位點甲基化程度明顯降低，導致IL-2基因轉錄活化。本研究顯示T細胞被激活后，DNA相應CpG位點發生去甲基化過程，使IL-2基因表達開放，以上結果提示:衰老過程中，基因啟動子區域特定CpG位點甲基化程度的增高或者去甲基化水平的降低，是導致老年大鼠IL-2基因轉錄水平下降的原因之一。

中醫“腎”的功能、陰陽平衡學說與衰老以及免疫調控之間關系密切〔9〕。機體在衰老進程中受體內外各種致病因素刺激，如果陰陽持續失衡，則加重疾病進展。腎寓真陰真陽，與人的生、長、壯、老、已關系密切。機體隨衰老腎氣不足、陰陽失調，免疫穩態失衡，最終導致陰陽離決，直至死亡。由此可見，陰陽虛損失衡是衰老的重要病機。根據此理論，張景岳所創左歸丸，重用熟地滋補真陰，為君藥，大量補陰藥中，少佐補陽之品，取其“陽中求陰”之義，陰陽并調，奏滋陰補腎，填精益髓之效，為補腎之陰陽的經典方劑〔10〕。本實驗發現，老年大鼠飲用左歸丸后，DNMTs活性減弱，Set1區域CpG位點甲基化程度下降，進而導致IL-2轉錄升高，延緩了細胞免疫功能退化的進程。

免疫調節是一種整體調節，免疫穩態的失衡是許多疾病發生發展的病理基礎，與陰陽的消長特性頗有類似之處。陰平陽秘是機體的自穩狀態，陰陽平衡是生命過程中系統穩態和動態的統一。左歸丸陰陽雙調的治法具有雙向、多靶點調節的特點〔10〕，在全方位調節衰老機體免疫內環境的平衡方面具有一定優勢，值得深入研究。

1 Thomas R.Malek.The biology of Interleukin-2〔J〕.Annu Rev Immunol，2008;26(2):453-79.

2 Crispín JC，Tsokos GC.Transcriptional regulation of IL-2 in health and autoimmunity〔J〕.Autoimmun Rev，2009;8(3):190-5.

3 Pioli C，Pucci C，Barile S，et al.Role of mRNA stability in the different patterns of cytokine production by CD4+cells from young and old mice〔J〕.Immunology，1998;94(3):380-7.

4 Adachi S，Rothenberg EV.Cell-type-specific epigenetic marking of the IL2 gene at a distal cis-regulatory region in competent，nontranscribing T-cells〔J〕.Nucleic Acids Res，2005;33(10):3200-10.

5 Wilson CB，Makar KW，Shnyreva M，et al.DNA methylation and the expanding epigenetics of T cell lineage commitment〔J〕.Semin Immunol，2005;17(1):105-19.

6 Shi L，Qiu DM，Zhao GH，et al.Dynamic binding of Ku80，Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells〔J〕.Nuc Acids Res，2007;35(7):2302-10.

7 Murayama A，Sakura K，Nakama M，et al.A specific CpG site demethylation in the human interleukin 2 gene promoter is an epigenetic memory〔J〕.EMBO J，2006;25(5):1081-92.

8 Rajan M，Thomas，Ling Gao，et al.Signals from CD28 induce stable epigenetic modification of the IL-2 promoter〔J〕.J Immunol，2005;1747:4639-46.

9 龔張斌，姚建平，金國琴.補腎方藥對老年大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質所屬組織結構形態變化的影響〔J〕.遼寧中醫雜志，2006;33(1):103-4.

10 龔張斌，徐品初，金國琴.左歸丸對大鼠凋亡胸腺細胞Bcl-2，Bax表達影響的研究〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(22):3290-2.