不同補腎陰方藥對慢性哮喘氣道重構的調節作用及其作用機制研究

佟雷+孫琳林+劉金麗+高月娟

[摘要] 左歸丸、六味地黃丸均含有“三補方”的組分，均對慢性哮喘具有治療作用。為研究3種補腎陰方劑的抗哮喘作用差異及其分子機制，以卵清白蛋白建立BALB/c小鼠慢性哮喘模型。模型動物分別灌胃給予左歸丸、六味地黃丸或三補方。給藥后觀察抓鼻次數、打噴嚏次數；肺部病理切片測定氣道平滑肌厚度、基底膜厚度、膠原沉積面積及杯狀細胞數；Western blot，RT-PCR法檢測肺組織MMP-9，TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad7的表達。結果顯示左歸丸組抓鼻次數、打噴嚏次數顯著低于三補方組，氣道重構抑制程度顯著高于三補方組；六味地黃丸組抓鼻次數、打噴嚏次數顯著低于三補方組，膠原沉積面積及杯狀細胞數顯著低于三補方組。4種氣道重構相關因子中，左歸丸組MMP-9，TGF-β1，Smad2，Smad3顯著低于三補方組，Smad7顯著高于三補方組。六味地黃丸組Smad7顯著高于三補方組，MMP-9與模型組及三補方組均無顯著差異。提示3種補腎陰藥方抗哮喘作用存在顯著差異，左歸丸對MMP-9的調節作用及六味地黃丸對Smad7的調節作用可能與3種組方對氣道重構抑制作用的差異有關。

[關鍵詞] 左歸丸； 六味地黃丸； 哮喘；氣道重構

Antiasthmatic effects of different tonifying kidney-Yin formulas and

their effects on airway remodeling in chronic asthma

TONG Lei1， SUN Lin-lin2， LIU Jin-li2， GAO Yue-juan2*

（1. Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China；

2. Hongqi Hospital， Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China）

[Abstract] Both of Zuogui Wan（ZGW） and Liuwei Dihuang Wan（LWDHW） contain ingredients of Sanbufang（SBF）， which have been proven to have antiasthmatic effects. In order to study the antiasthmatic effects of the three tonifying kidney-Yin formulas and their mechanisms， BALB/c mice were randomly divided into 5 groups. Chronic asthma was induced by ovalbumin. Mice in treated groups were respectively given 49.0 g·kg-1ZGW， 35.0 g·kg-1LWDHW and 22.4 g·kg-1SBF by gavage. Those in normal and model group were given normal saline. After treatment， sneeze and nose scratching times of mice were observed. Histological lung sections were prepared to determine the basement membrane thickness（BMT）， smooth muscle thickness（SMT）， collagen area（CA） and numbers of goblet cells（GCN）. Western blotting and RT-PCR were used to determine the expression levels of MMP-9， TGF-β1， Smad2， Smad3 and Smad7. The results showed that sneeze and nose scratching times of ZGW group were significantly lower than those of SBF group. Its inhibition degree on airway remodeling was significantly higher than SBF group. Sneeze and nose scratching times of LWDHW group were significantly lower than SBF group. Its CA and GCN were significantly lower than SBF group. Regarding the four airway remodeling related factors， MMP-9， TGF-β1， Smad2 and Smad3 of ZGW group were significantly lower than those of SBF group， and its Smad7 was significantly higher than SBF. Smad7 of LWDHW group was significantly higher than SBF. There was no significant difference in MMP-9 between model group and SBF group. The results indicate that there are significant differences in the antiasthma effect of these tonifying kidney-Yin formulas. The regulatory effects of ZGW and LWDHW on MMP-9 and Smad7 may be correlated with the differences in the inhibitory effect of airway remodeling of the three formulas.

[Key Words] Zuogui Wan； Liuwei Dihuang Wan； asthma； airway remodeling

哮喘是由遺傳因素及環境因素誘發的肺部炎癥反應。在全球各年齡段人群中，其患病人數多達3億人，以兒童和老年人為主。我國兒童哮喘發病率約為2.38% [1]。早期認為炎癥、支氣管平滑肌痙攣是哮喘的主要病因，因此臨床常用抗毒蕈堿藥物、白三烯抑制劑及皮質類固醇藥物進行治療。化學藥物對緩解哮喘急性發作具有顯著優勢，但不宜長期服用。近年來研究表明，氣道重構是哮喘的主要病因，也是其易于反復發作的原因之一[2]。

中醫學理論認為，哮喘與先天腎臟虧虛及后天肺臟虛損有關。因此補腎法是中醫治療哮喘的常用方法之一[3]。六味地黃丸是常用補腎方劑，已在臨床用于哮喘的治療。其上調肺組織IFN-γ mRNA的作用與布地奈德無顯著差異[4]。左歸丸出自《景岳全書》，由明代張景岳從六味地黃丸組方中保留“三補”組方，加入補腎陰及補陽益陰中藥而得，是我國沈自尹院士治療哮喘的常用方藥之一。

然而，國內外關于左歸丸、六味地黃丸的抗哮喘作用機制研究尚少，對不同補腎方劑抗哮喘作用的比較研究也鮮有報道。鑒于左歸丸、六味地黃丸及六味地黃丸中的“三補”方具有共同的組方成分，且均為補腎陰方藥，本研究對3種補腎陰方藥對哮喘模型動物氣道重構及相關因子的調節作用進行了比較研究，以期了解其抗哮喘作用差異及其作用機制差異。

1 材料

1.1 藥物 左歸丸（熟地黃-菟絲子-牛膝-龜板膠-鹿角膠-山藥-山茱萸-枸杞子8∶4∶3∶4∶4∶4∶4∶4）及三補方（熟地黃-山藥-山茱萸2∶1∶1）藥材飲片購自同仁堂藥店牡丹江店，加水煎煮3次，合并煎液，左歸丸濃縮成含生藥6.3 g·mL-1，三補方濃縮成含生藥2.8 g·mL-1。六味地黃顆粒（江陰天江藥業有限公司，批號1505029；組方：熟地黃-山藥-制山茱萸-茯苓-澤瀉-牡丹皮8∶4∶4∶3∶3∶3）。

1.2 動物 SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。實驗動物購入后，檢疫7 d，12 h/12 h明暗循環，自由攝食攝水，飼料為滅菌小鼠飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，批號201510220921），飲用水為滅菌水。實驗方案經本單位實驗動物倫理委員會批準，動物飼養及實驗操作均符合實驗動物倫理要求。

1.3 試劑 RIPA 裂解液（北京雷根生物技術有限公司）；增強化學發光溶液（美國Sigma-Aldrich）；卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA，美國Sigma-Aldrich公司）；無RNA 酶的DNA酶（美國Promega公司）；抗小鼠MMP-9，TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad7抗體均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.4 儀器 全身式吸入暴露箱（美國NatureGene Corp）；QA40超聲波噴霧器（美國Qsonica Misonix公司）；RM2145病理切片機（德國 LEICA 公司）；N-180M雙目生物顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司）；CMIAS多功能彩色病理圖象分析系統（北京航空航天大學圖像中心）；DY89-1電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZF-258凝膠成像分析系統（上海嘉鵬科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥方案 按隨機數字表法將小鼠隨機分為5組，每組12只，苦味酸標記編號。參考文獻方法采用OVA建立慢性哮喘模型[5]，略作修改。分別于第0，7天腹腔注射50 μg OVA，1 mg Al（OH）3（混懸于0.2 mL磷酸鹽緩沖液）致敏。將OVA混懸于磷酸鹽緩沖液，質量濃度為25 g·L-1，通過超聲波霧化器制備OVA氣溶膠，微粒直徑0.5～20 μm。第12，15，19，22，26，29天將小鼠置于全身式吸入暴露箱，以0.5 cm3·min-1速度通入氣溶膠，共通入30 min，使箱內OVA濃度接近3 mg·m-3進行激發。正常組小鼠以磷酸鹽緩沖液代替OVA。

第29天開始（激發后），各組動物給藥如下：正常組及模型組小鼠灌胃給予生理鹽水；左歸丸組小鼠灌胃給予左歸丸提取液，按生藥計算劑量為49.0 g·kg-1；六味地黃丸組灌胃給予六味地黃顆粒水混懸液，按生藥計算劑量為35.0 g·kg-1；三補方組灌胃給予三補方提取液，按生藥計算劑量為22.4 g·kg-1；各組動物每日給藥1次，連續給藥14 d。按左歸丸、六味地黃丸、三補方組方計算，各組動物熟地黃、山藥、山茱萸給藥劑量相等。

2.2 小鼠行為學觀察 造模過程中對各組小鼠進行行為學觀察，觀察內容包括毛色光潔程度、呼吸頻率、抓鼻次數、打噴嚏次數等。末次給藥后24 h內（早9～10時、午13～14時、晚17～18時），對各組小鼠抓鼻次數和打噴嚏次數進行計數。

2.3 小鼠肺組織病理學觀察 末次給藥后24 h，每組小鼠隨機選取6只，3%戊巴比妥鈉麻醉處死，開胸腔，取右側肺葉，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，乙醇梯度脫水，切4 μm薄片，每隔6張取1張切片，分別進行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）、阿辛藍過碘酸雪夫氏染色（Alcian blue-periodic acid-schiff stain，AB-PAS）和Masson染色[6]。數字編碼后由病理技術人員盲法閱片，200倍光鏡下觀察小鼠氣道顯微結構：道杯狀細胞增生及膠原沉積情況。氣道平滑肌厚度、基底膜厚度測定中每個氣道取5個觀察點。杯狀細胞計數時，以每500個細胞中的杯狀細胞個數表示（n/500）。膠原沉積面積以氣道上皮基底膜上的膠原沉積面積（μm2）/氣道上皮長度（μm）表示。

2.4 Western blot檢測 參考文獻方法[7]，采用 Western blot法測定小鼠肺組織氣道重構相關蛋白MMP-9，TGF-β1及Smad2，Smad3，Smad7的蛋白含量。末次給藥后24 h，每組剩余小鼠取左側肺葉，剪碎，加入RIPA 裂解液（含50 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，0.1%十二烷基硫酸鈉），冰上溶脹10 min，4 ℃下15 000 r·min-1離心15 min。上清液上10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維素膜，PBST（磷酸鹽緩沖液含0.1%吐溫20）洗膜，脫脂奶粉封閉（5%脫脂乳-磷酸鹽緩沖液溶液）1 h，PBST洗膜后分別加入抗小鼠MMP-9（1∶1 000），TGF-β1（1∶1 000），Smad2（1∶1 000），Smad3（1∶2 000），Smad7（1∶1 000）抗體孵育1 h。再次PBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶1 000）孵育1 h。GPADH作為內參。增強化學發光溶液顯色，采用凝膠成像分析系統進行分析。

2.5 RT-PCR檢測 參考文獻方法[8] ，采用RT-PCR法測定小鼠肺組織氣道重構相關MMP-9，TGF-β1及Smad2，Smad3，Smad7 mRNA的表達，末次給藥后24 h，每組剩余小鼠取右側肺葉，Trizol試劑提取總RNA，采用無RNA酶的DNA酶處理RNA樣品以除去污染的DNA。cDNA擴增引物包括：MMP-9上游引物5′-GGAGACCTGAGAACCAATCTC-3′，下游引物5′-TCCAATAGGTGATGTCGT-3′，277 bp；TGF-β1上游引物5′-ACCTGCAAGACCATCGACAT-3′，下游引物5′-GGTTTTCTCATAGATGGCGT-3′，279 bp；Smad2上游引物5′-GCCACATGTTATATATTGCC-3′，下游引物5′-TTACACACTGTTGCAGGGT-3′，220 bp；Smad3上游引物5′-GGGCTCCCTCATGTCATCTA-3′，下游引物5′-GGCTCGCAGTAGGTAACTGG-3′，176 bp；Smad7上游引物5′-CTCCTGCTGTGCAAATGTTTC-3′，下游引物5′-CAGGCTCCAGAAGAAGTTGG-3′，207 bp；GAPDH上游引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，150 bp。94 ℃變性3 min，然后94 ℃變性3 s，60 ℃引物退火30 s，72 ℃延伸1 min（35個循環），最后72 ℃延伸10 min。2-ΔΔCt法定量分析。

2.6 統計學分析 數據以±s表示，采用SPSS 17.0進行分析。組間比較采用t檢驗。P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

3 結果

3.1 行為學評價 除正常組小鼠外，其余各組小鼠OVA激發后表現出明顯的癥狀，包括呼吸急促、趴臥、鼻癢抓鼻、打噴嚏、豎毛、點頭呼吸等。分別于激發結束后首次給藥前及末次給藥結束24 h，計數各組小鼠在早中晚3個時間段共3 h內的鼻癢抓鼻次數和打噴嚏次數，見表1。模型組及給藥組抓鼻次數、打噴嚏次數均極顯著高于正常組（P<0.01）。左歸丸組小鼠抓鼻次數、打噴嚏次數極顯著低于模型組和三補方組（P<0.01）；六味地黃丸組抓鼻次數、打噴嚏次數極顯著低于模型組（P<0.01），顯著低于三補方組（P<0.05）。

3.2 肺組織病理學觀察 分別采用3種染色方法對小鼠肺組織切片進行染色，以觀察小鼠氣道病理改變。與正常組小鼠相比，模型組小鼠肺組織病理切片中支氣管及血管周圍炎性細胞數量顯著增多，黏液分泌增多，并存在基底膜增厚、平滑肌增厚和膠原沉積現象。各組小鼠典型的肺組織病理切片見圖1。

比較各組動物肺組織平滑肌厚度、基底膜厚度、膠原沉淀面積及杯狀細胞數。與正常組比較，模型組小鼠平滑肌厚度、基底膜厚度、膠原沉淀面積及杯狀細胞數均顯著升高（P<0.01）。左歸丸組基底膜厚度、膠原沉淀面積和杯狀細胞個數均顯著高于正常組（P<0.05），低于模型組（P<0.01）和三補方組（P<0.05或P<0.01），平滑肌厚度顯著低于三補方組（P<0.01），與正常組無顯著差異。六味地黃組平滑肌厚度、基底膜厚與三補方組無顯著差異，但膠原沉淀面積和杯狀細胞數均顯著低于三補方組（P<0.05），見表2。

3.3 Western blot檢測 左歸丸組小鼠肺組織中TGF-β1，Smad2，Smad3表達量極顯著高于正常組（P<0.01），極顯著低于模型組（P<0.01）；其中TGF-β1，Smad2表達量顯著低于三補方組（P<0.05），Smad3表達量極顯著低于三補方組（P<0.01）。該組小鼠MMP-9表達量顯著高于正常組（P<0.05），極顯著低于模型組和三補方組（P<0.01）。其Smad7表達量顯著低于正常組（P<0.05），極顯著高于模型組和三補方組（P<0.01）。

六味地黃丸組小鼠肺組織中TGF-β1，Smad2表達量極顯著高于正常組（P<0.01），顯著低于模型組（P<0.05），與三補方組無顯著差異。該組小鼠MMP-9表達量極顯著高于正常組（P<0.01），與模型組和三補方組無顯著其差異。Smad7表達量極顯著低于正常組（P<0.01），極顯著高于模型組（P<0.01），顯著高于三補方組（P<0.05）。結果見圖2、表3。

3.4 RT-PCR檢測 在MMP-9 mRNA方面，左歸丸組表達水平顯著高于正常組（P<0.05），顯著低于模型組（P<0.05），極顯著低于三補方組（P<0.01）；六味地黃丸組表達水平極顯著高于正常組（P<0.01），與模型組和三補方組無顯著差異。

在Smad7 mRNA方面，左歸丸組表達水平顯著低于正常組（P<0.05），極顯著高于模型組（P<0.01）和三補方組（P<0.01）；六味地黃丸組表達水平極顯著低于正常組（P<0.01），極顯著高于模型組（P<0.01），顯著高于三補方組（P<0.05）。

在TGF-β1 mRNA和Smad2 mRNA方面，左歸丸組表達水平極顯著高于正常組（P<0.01），極顯著低于模型組（P<0.01），顯著低于三補方組（P<0.05）；六味地黃丸組表達水平極顯著高于正常組（P<0.01），顯著高于模型組（P<0.05），與三補方組無顯著差異；三補方組顯著低于模型組（P<0.05）。

在Smad3 mRNA方面，左歸丸組表達水平極顯著高于正常組（P<0.01），極顯著低于模型組和三補方組（P<0.01）；六味地黃丸組表達水平極顯著高于正常組（P<0.01），顯著高于模型組（P<0.05），與三補方組無顯著差異；三補方組與模型組無顯著差異。結果見圖3、表4。

4 討論

哮喘是一種以氣道高反應和可逆性氣道阻塞為特征的慢性氣道炎癥性疾病。氣道炎癥、組織損傷及隨后的異常修復會導致哮喘患者氣道壁的結構變化，包括平滑肌增厚、基底膜增厚、膠原沉積、杯狀細胞增多等，統稱為氣道重構。已有大量證據顯示，氣道重構是導致肺部不可逆或部分可逆性氣流阻塞，以及哮喘致死的主要原因[9]。

目前關于氣道重構具體機制尚不清楚。其中可能的機制之一被認為是細胞外基質產生與膠原降解失衡所致。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在控制膠原降解及組織修復中發揮著重要作用[10]。

而轉化生長因子β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）則被證明與氣道重構相關的大多數細胞生物學過程相關[11]，包括促進平滑肌和杯狀細胞增生，促進氣道膠原沉積和基底膜增厚等[12]。TGF-β1主要通過對Smad（mothers against decapentaplegic homology）蛋白對氣道重構的影響，包括Smad2，Smad3，Smad7等。其中Smad2，Smad3與氣道重構正相關，Smad7與氣道重構負相關[13]。

左歸丸演化自六味地黃丸，具有補而不泄，陽中求陰的特點，與六味地黃丸含有同等比例的熟地黃、山藥、山茱萸（三補方）。該研究比較了3種補腎陰藥方對慢性哮喘小鼠的抗哮喘作用及其對小鼠哮喘模型氣道重構的影響。六味地黃顆粒具有抑制哮喘動物模型氣道基底膜增厚的作用，與文獻報道一致[4]。

通過對比研究表明，左歸丸對小鼠哮喘的抑制作用以及對氣道顯微結構和氣道重構相關因子TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad7的調節作用均優于六味地黃丸（P<0.05或P<0.01）。其中左歸丸對MMP-9具有下調作用，而六味地黃丸組及三補方組MMP-9表達水平與模型組無顯著差異。六味地黃丸對小鼠哮喘的抑制作用顯著優于三補方（P<0.05），對氣道膠原沉積及杯狀細胞增生的抑制作用也優于三補方（P<0.05），但二者對MMP-9及TGF-β1表達的抑制作用無顯著差異。

從3種藥方的組方構成分析，左歸丸藥方中加入的補腎陰中藥可能是導致其對哮喘抑制作用優于六味地黃丸和三補方的原因，其中枸杞已被證明對哮喘具有治療作用[12]。說明補腎陰藥物的加入有利于增強中藥復方的抗哮喘作用。六味地黃丸與三補方相比存在三瀉成分（茯苓、澤瀉、丹皮），具有補而不膩的功效，其中茯苓已在臨床用于哮喘的治療[12]。通過與三補方的藥效對比可見，三瀉成分對三補成分的抗哮喘作用無顯著降低作用。

結合作用機制分析，左歸丸對哮喘小鼠氣道MMP-9表達的顯著下調作用，可能與其加入的補腎陰藥物有關。而六味地黃丸三瀉成分的加入，可能是其對Smad7下調作用低于三補方（P<0.05）及對膠原沉積和杯狀細胞增生抑制作用高于三補方（P<0.05）的原因。已有文獻報道，Smad7與氣道黏液分泌增多及細胞外基質沉積有關[13]。但由于中藥多為復方，其中化學成分較為復雜。因此尚需對3種組方進行拆方研究，以進一步明確各種組方成分對藥效及作用機制的貢獻。另外，通過上述研究可以發現，補腎陰方抗哮喘作用機制復雜，涉及多種相關蛋白表達，因此有必要采用現代分子生物學手段，在分子水平上對補腎陰方藥的配伍規律進行更為細致的研究，研發抗哮喘作用強、成分明確、作用機制清楚的安全有效的中藥新藥。

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[責任編輯 張寧寧]