左歸丸對去勢大鼠鈣轉運通路相關蛋白的影響

唐皓 余娜 仇湘中 王哲享

〔摘要〕 目的 探討左歸丸去勢大鼠骨密度和骨、腎組織中鈣轉運通路相關蛋白的影響。方法 選取48只雌性SD大鼠，隨機分為正常組，假手術組，模型組，西藥組，中藥低、高劑量組。除假手術組和正常組，其余組切除大鼠卵巢，造模成功后3個月進行各組干預。3個月后處死大鼠，檢測大鼠骨密度（BMD）;Western blotting法檢測鈣轉運通路（腎組織）蛋白表達;免疫組化檢測去勢大鼠骨組織中新型上皮鈣通道5（TRPV5）蛋白的表達。結果 與模型組相比，左歸丸高劑量組與西藥組大鼠骨密度均有改善（P<0.05）;與假手術組比較，模型組各蛋白表達均有不同程度下降（P<0.01，P<0.05）;尼爾雌醇和左歸丸均能不同程度上調去勢大鼠腎組織中TRPV5蛋白、鈉鈣交換器（NCX1）蛋白、鈣結合蛋白-D28K（CaBP-D28K）和細胞膜鈣汞（PMCA1b）蛋白表達，差異均具有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;免疫組化顯示模型組較假手術組的TRPV5蛋白表達率增加（P<0.05），而西藥組和中藥高、低劑量組較模型組蛋白表達率均下降（P<0.05）。結論 左歸丸可通過上調腎鈣轉運通路中相關蛋白的表達和降低大鼠破骨細胞中TRPV5蛋白的表達，而發揮骨質疏松癥治療作用，腎、骨組織中鈣轉運過程相關蛋白可能成為骨質疏松癥治療的新方向、新靶點。

〔關鍵詞〕 左歸丸;去勢大鼠;鈣轉運通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.10.006

Effects of Zuogui Pills on Calcium Transport Pathway-related Proteins in Ovariectomized Rats

TANG Hao1， YU Na2*， QIU Xiangzhong1， WANG Zhexiang1

（1. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Zuogui Pills on bone mineral density （BMD） and related proteins involved in calcium transport pathway in bone and renal tissues of ovariectomized rats. Methods A total of 48 female SD rats were randomly divided a normal group， a sham operation group， a model group， a western medicine group， and a low and high dose Zuogui Pills group. Except the sham operation group and the normal group， ovaries of the rats in the other groups were removed， and the intervention of each group was carried out 3 months after the successful establishment of the model. Three months later， the rats were killed to detect the BMD; expressions of proteins involved in calcium transport pathway （renal tissue） was detected by Western blotting; and protein expression of TRPV5 in bone tissue of ovariectomized rats was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the BMD of rats in the high dose Zuogui Pills group and western medicine group was increased （P<0.05）; compared with the sham operation group， the expressions of proteins in the model group were decreased in varying degrees （P<0.01， P<0.05）; Nilestriol and Zuogui Pills could increase the expressions of TRPV5 （transient receptor potential cation channel， subfamily V， member 5） protein， NCX1 （Sodium-calcium exchanger 1）， CaBP-D28K （Calcium-binding protein-D28K） and PMCA1b （Plasma membrane Ca2-ATPase 1b） in the renal tissue of ovariectomized rats in different degrees， and the differences were statistically significant （P<0.05， P<0.01）; immunohistochemistry showed that the expression of TRPV5 protein in the model group was increased compared with that in the sham operation group （P<0.05）， while the protein expression rates in the western medicine group as well as high and low dose Zuogui Pills groups were decreased compared with that in the model group （P<0.05）. Conclusion Zuogui Pills can play a therapeutic role in osteoporosis by increasing the expressions of related proteins involved in renal calcium transport pathway and decrease the expression of TRPV5 protein in rat osteoclasts. The related proteins involved in calcium transport pathway in bone and renal tissues may become a new direction and target in the treatment of osteoporosis.

〔Keywords〕 Zuogui Pills; ovariectomized rats; calcium transport pathway

近幾年骨質疏松的發病人數在我國已經明顯上升，在60～70歲階段，約33%的女性和20%的男性患有該疾病，骨質疏松流行病對中老年人的生命安全、身體健康等形成一定的危害與威脅[1]。到2050年中國骨質疏松癥或骨密度低的患者將達到2.12億[2]，骨質疏松癥歸屬于中醫學“骨痿”“骨痹”范疇。中醫學認為，腎主骨，腎虛是絕經后骨質疏松癥發生的始動病機[3-4]，腎精盛衰直接決定機體生、長、壯、老、已的生命活動狀態。而骨的生長發育狀況也直接與腎精盛衰密切相關。左歸丸是滋陰補腎、填精益髓的名方，實驗研究證明，左歸丸具有類雌激素作用，能促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞的活性，維持二者的動態平衡，為中醫“腎主骨”理論提供了有利的實驗依據[5-6]。瞬時性受體電位通道（transient receptor potential，TRP）家族成員新型上皮鈣通道5（TRPV5）是已知TRP中鈣離子高選擇性通道[7]，它在機體鈣離子跨上皮轉運方面發揮重要作用，參與調節整個機體的鈣平衡。其介導的腎鈣及骨鈣轉運過程與骨質疏松癥的鈣代謝紊亂有著密切的聯系。本研究擬基于TRPV5介導的鈣轉運通路（腎組織、骨組織）探討補腎經典方劑左歸丸對骨質疏松癥模型大鼠的療效及作用機制。

1 材料

1.1? 動物與藥物

6月齡雌性SPF級SD大鼠48只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物治療合格證號43004700022760。左歸丸配方：熟地黃24 g，山藥12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟絲子12 g，鹿膠12 g，龜膠12 g（由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科提供），將藥物水煎2次，合并濾液并濃縮致0.48 g（生藥量）/mL（相當臨床等效劑量）、1.92 g（生藥量）/mL濃度的藥液（相當于臨床4倍量）。尼爾雌醇（購自上海醫藥（集團）有限公司新華聯制藥廠生產，國藥準字：H31021647，規格2 mg/片）。

1.2? 主要試劑

TRPV5（貨號17322-1-ap）、CaBP-D28k（貨號14479-1-ap）、NCX1（貨號55075-1-ap）兔抗體均由（美國）proteintech公司提供;β-actin鼠抗體（貨號60008-1-Ig）、PMCAIb（貨號ab190355）兔抗體購自英國abcam公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG購自美國Proteintech公司;中性樹膠購自Sigma公司;蘇木素、PBS（PH7.2-7.6）和枸櫞酸鹽緩沖液購自Wellbio公司;二步法試劑盒、DBA試劑盒購自中杉金橋公司。

1.3? 主要儀器

電泳儀（美國Bio-rad公司）;蛋白酶抑制劑（德國Merck公司）;臺式高速冷凍離心機（中國深圳黑馬公司）;全自動酶標洗板機和多功能酶標分析儀（匯松公司）;電泳槽（中國北京六一公司）;轉膜儀（中國北京六一公司）;包埋機（常州中威電子儀器公司）、顯微鏡（Motic公司）。

2 方法

2.1? 分組

將大鼠隨機分成左歸丸高劑量組、左歸丸低劑量組、西藥組、模型組、正常組及假手術組，每組8只。除假手術組和正常組，其余組均切除大鼠雙側卵巢復制絕經后大鼠骨質疏松動物模型。

2.2? 造模

造模方法參照文獻[8]，10%水合氯醛溶液對大鼠按0.33 mL/100 g體質量腹腔注射進行麻醉，將假手術組大鼠背部切開，進入腹腔，將卵巢找到，從其旁將一定量的脂肪（1 g左右）剪除。將切除卵巢組大鼠距脊柱外側約1 cm與背部腋中線交叉部位的皮膚切開，腹腔打開，行兩側卵巢摘除術。傷口消毒7 d，觀察傷口愈合情況。

2.3? 給藥劑量及方法

6組大鼠自由攝食、飲水，術后3月行活體骨密度（bone mineral density， BMD）檢測驗證模型復制成功，進行分組治療干預。按70 kg的成人一天服用左歸丸的生藥量為105 g計算，人的給藥量為1.5 g/（kg·d），按照動物與人體表面積換算法，大鼠的臨床等效給藥量應為9.45 g/（kg·d）。每組大鼠的給藥體積均為20 mL/（kg·d），根據大鼠每日給藥量與給藥體積，制備左歸丸低濃度煎劑為0.48 g生藥/mL（相當于臨床等效給藥量）、左歸丸高濃度煎劑1.92 g生藥/mL（相當于臨床4倍量）。

中藥低劑量組給予左歸丸低濃度煎劑（0.48 g/mL），體積為20 mL/（kg·d）;中藥高劑量組給予左歸丸高濃度煎劑（1.92 g/mL），體積為20 mL/（kg·d）;西藥組給予尼爾雌醇1 mL/（kg·d）灌胃，使用前配成混懸液（濃度為0.167 mg/mL），1次/周，其余時間予生理鹽水20 mL/（kg·d）灌胃;假手術組和模型組的大鼠給予體20 mL/（kg·d）的生理鹽水灌胃飼服。以上干預治療均持續3個月。

2.4? 腎樣品和股骨頭的標本制備

腎樣品制備：剪取大鼠0.25 g腎組織，用冰預冷PBS洗組織，加入200 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復研磨組織直至看不見組織塊，以備Western Blot法檢測大鼠腎組織中TRPV5介導的鈣轉運通路相關蛋白的表達。

股骨樣品制備：將大鼠肌肉筋膜（附著在右后肢股骨）剔掉，以便進行大鼠樣本骨密度檢測。剪碎大鼠樣本的暴露股骨（即大鼠左后肢股骨干骺端），以備免疫組化測試骨樣本骨組織中TRPV5蛋白的表達。

2.5? 觀測指標

2.5.1? 大鼠離體股骨上1/3 BMD測定? 肌肉筋膜（右后肢全股骨）剔除條件下隨之需要選擇生理鹽水將樣本的筋膜洗凈，用紗布和錫紙將筋膜裹好，雙能X線骨密度儀（XR-26型）進行大鼠樣本的骨密度測試，采用The Small Subject Scout Scan軟件進行數據研究。

2.5.2? Western Blot法檢測大鼠腎組織中TRPV5介導的鈣轉運通路相關蛋白的表達? 通過清洗、蛋白裂解、離心制備好腎樣品;隨后繪制蛋白標準曲線，算出蛋白濃度。灌膠、上樣，根據蛋白定量的結果，計算出所有樣品取樣量，電泳、轉膜。按TRPV5（83KD）、CaBP-D28k（28KD）、NCX1（120KD）、PMCAIb（130-250KD）、β-actin（42KD）所在位置進行切膠;室溫條件下于TBST溶液（含5%脫脂奶粉）內封閉膜（載蛋白質條帶）60 min。進行一抗孵育、二抗孵育;孵育洗滌后，采用ECL化學發光顯示液曝光。

2.5.3? 免疫組化測試骨樣本骨組織中TRPV5蛋白的表達? 將股骨樣品切片脫蠟至水;尿素、胰酶修復抗原;加入3% H2O2，室溫10 min以滅活內源性酶。PBS沖洗3 min×3次;進行孵育一抗、 孵育二抗、DAB顯色;蘇木素復染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍;各級酒精（60%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。使用IPP軟件分析圖像。

2.6? 統計學方法

分析基于SPSS 17.0完成。單因素方差分析多組對比，t檢驗兩組對比，結果用“x±s”表示。P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1? 大鼠離體股骨上1/3 BMD測定

BMD檢測結果：正常組大鼠與假手術組差異無統計學意義。與假手術組相比，模型組大鼠BMD顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，中藥高劑量組、和西藥組大鼠BMD均得到改善（P<0.01）。與模型組中的大鼠相比，中藥低劑量組大鼠樣本BMD升高差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3.2? 大鼠腎組織中TRPV5介導的鈣轉運通路相關蛋白的表達

如圖1所示Western法結果如下：和假手術組比較，模型組各蛋白表達均有不同程度下調（P<0.01、P<0.05）;與模型組相比，西藥組和中藥高劑量組中TRPV5蛋白與NCX1蛋白表達均有上調（P<0.05），CaBP-D28k蛋白表達有明顯上調（P<0.01）;與模型組比較，PMCA1b蛋白表達在西藥組和中藥低劑量組中均有明顯上調（P<0.01）。

3.3? 大鼠骨組織中TRPV5蛋白的表達

大鼠骨組織中TRPV5蛋白的陽性表達為細胞膜和胞漿被染成棕黃色。模型組TRPV5蛋白的陽性表達較假手術組的陽性細胞表達增加（P<0.05），而西藥組和中藥高、低劑量組較模型組陽性細胞表達下降（P<0.05）。見表2和圖2。

4 討論

骨質疏松癥屬于中醫學“骨痿”，骨痿中醫病理本質核心是“腎虛髓虧”。中醫學認為“腎藏精”即腎中精氣是人體生理活動的原動力，腎精盛衰決定機體生、長、壯、老、已的生命活動狀態。腎中精氣不僅促進機體生長發育，同時也保證骨骼正常功能，因此，骨骼的生長發育狀況也直接與腎精的盛衰密切相關。左歸丸出自明代張景岳的《景岳全書·新方八陣》，主治真陰腎水不足，藥物陰陽俱用，寓陽中求陰之意。補腎填精法是防治骨痿的基本大法，所以左歸丸作為補腎填精的經典方，在防治骨質疏松癥有很好的臨床療效。現代研究也證實左歸丸具有類似雌激素樣的調節作用，不僅能使血清骨鈣素含量增加、降鈣素含量降低[9]，升高大鼠骨量，改善骨小梁細小、稀疏和三維結構破壞的狀況[10]，還能降低骨髓基質細胞IL-1和成骨細胞IL-6的表達和腎組織中TGF-β1、Smad4的mRNA的表達[11-12]，從而達到糾正鈣代謝紊亂，防治骨質疏松癥的目的。

鈣代謝紊亂是骨質疏松癥發病的重要原因之一，鈣離子通道的調控直接影響骨的代謝[13]。現代研究證實TRPV5介導的鈣轉運通路存在于包括人與鼠類、兔等哺乳動物組織器官（如骨組織、腎臟等）。機體內鈣穩態的調節主要靠腎、骨等器官的協調平衡，即腎鈣濾過與重吸收，及骨鈣的沉積與釋放，從而達到調節血鈣平衡的作用。腎鈣的重吸收以及骨鈣釋放均與新型上皮鈣通道TRPV5介導的鈣轉運通路密切相關。

腎臟是鈣平衡重要器官之一，它是通過腎小球的濾過和腎小管的重吸收作用下完成的。現代研究證實TRPV5介導鈣離子轉運通道，其表達下降或缺乏可使腎小管對鈣的重吸收減少[14-15]，這一過程主要是依賴濃度梯度的被動轉運過程，也有少量的主動鈣轉運過程。腎鈣重吸收過程也是以主動轉運過程為主，CaBP-D28k與鈣離子有較高的親和力，因此在腎臟鈣轉運過程中發揮著非常重要的作用[16]，主要負責胞內鈣離子的緩沖和向基底膜側的運輸。另外在基底膜上的Ca2+-ATP酶，在鈣離子出膜轉運中起鈣泵的作用。位于基底膜的NCX1也是鈣離子出胞所必需的溢出機制。而介導鈣離子入膜的通道蛋白TRPV5是腎鈣轉運的主要入膜機制。PMCA是P型ATPase家族中最大的[17]，它是鈣離子的流出泵（通常具有高親和力），鈣含量（細胞中）是否能保持穩定狀態主要取決于這種物質。

骨是調節鈣平衡的關鍵器官之一，TRPV5作為介導破骨細胞骨吸收的重要通道蛋白，其影響成骨細胞和破骨細胞活性，促進成骨方向的骨代謝轉變，提高骨密度已經得到證實[18]。

基于TRPV5與腎鈣轉運和骨鈣轉運的聯系，本研究試探討左歸丸對TRPV5介導的腎鈣、骨鈣轉運通路相關蛋白的影響。研究發現，模型組去卵巢大鼠骨密度下降，標志著骨質疏松模型大鼠造模成功。采用尼爾雌醇與左歸丸干預后，大鼠骨密度均有上升，提示雌激素與左歸丸均有抗骨質疏松的作用。模型組大鼠腎組織中TRPV5、CaBP-D28K、PMCA1b、NCX1等介導腎鈣轉運過程重要通道蛋白均有下降，提示骨質疏松癥是因為腎鈣轉運過程被抑制而致鈣代謝紊亂引起。而尼爾雌醇及左歸丸均可不同程度的上調上述蛋白的表達，提示左歸丸通過上調腎鈣轉運過程重要通道蛋白而發揮對骨質疏松的治療作用。而免疫組化結果顯示，模型組較假手術組的TRPV5蛋白表達明顯增加，而西藥組和中藥高、低劑量組較模型組TRPV5蛋白表達下降。提示去卵巢大鼠破骨細胞的骨吸收增強，而雌激素及左歸丸的抗骨質疏松機制有可能是通過抑制TRPV5介導的破骨細胞的骨吸收而起作用。

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