云南野生粗網柄牛肝菌粗多糖提取工藝及抗氧化能力的研究*

王浩華，謝美華，2，宋信信

(1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000;2.云南省高校應用生物學重點實驗室，云南 楚雄 675000)

粗網柄牛肝菌 (Boletus ornatipes Peck)屬傘菌目、牛肝菌科、牛肝菌屬，是一類外生菌根菌，夏秋季生于闊葉林中地上，群生或單生，廣東、四川、江蘇、安徽、云南等地都有分布［1］。食用菌多糖發展前景廣闊，具有重大的開發利用價值，新型藥物越來越多地應用于臨床，綠色、天然、安全、高效的食用菌多糖必將成為探索和發掘功能性食品和新型藥物制劑的重要領域之一［2—5］。牛肝菌作為肉質大型真菌目前開發廣泛，粗網柄牛肝菌作為其中的組成成員具有很好的開發潛力。提取多糖的方法有微波、熱水浸提、超聲波超臨界流體萃取，酶解法和酸堿法，這些方法各有優缺點。目前，對粗網柄牛肝菌多糖的提取方法還未見報道，本文采用正交試驗法優選粗網柄牛肝菌多糖提取工藝，旨在為其的進一步開發利用提供一定的理論依據。

1.材料與方法

1.1 材料

采集云南省楚雄市闊葉林中的野生粗網柄牛肝菌子實體，用蒸餾水沖洗干凈，切成片狀放入白色瓷盤中，105℃烘干30min后90℃恒重24h之后取出研磨成粉狀過40目篩。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的制備［6］

所得線性回歸方程為y=0.0148x－0.0002，R2=0.9994。說明線性良好。

1.2.2 粗網柄牛肝菌真菌多糖的提取單因素試驗

用電子天平準確稱取三份0.5g粗網柄牛肝菌的子實體粉末放入三個燒杯中，編號A，B，C.往三個燒杯中加水30ml。將A放入微波爐中微波5min，B用熱水浸提放提取2小時，C用超聲波法20min。之后分別過濾，取濾液，加入活性炭除去色素，抽濾后取濾液用sevage法除蛋白質，進行離心，離心后取上層清液即為粗網柄牛肝菌粗多糖液。吸取A，B，C中的真菌多糖溶液用苯酚－硫酸比色法在490nm下測定其吸光度。

1.2.3 正交試驗

通過單因素的試驗結果設計三因素三水平正交試驗 (表1)。

表1 因素與水平TableTable 1.factors and levels

1.2.4 最佳提取條件的驗證試驗

為了驗證結果的穩定性，每組稱取原料粉0.5g，每組試驗3個重復進行多糖的提取。

1.2.5 粗網柄牛肝菌多糖抗氧化能力的研究，DPPH法［7—8］。

2.結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果表明，微波法提取的效果最好，與熱水浸提法相比在5%水平顯著差異，與超聲波提取法相比在1%水平差異極顯著 (表2)。

表2 單因素提取粗網柄牛肝菌多糖的結果Table 3 Result of Single factor methods on polysaccharides of Boletus ornatipes

2.2 正交試驗結果

2.2.1 從試驗結果得出，最佳提取方法是微波加熱6min、1∶60的料液比、提取3次。極差分析結果表明，對粗網柄牛肝菌多糖得率的影響依次為料液比、微波時間、提取次數 (表3)。對粗網柄牛肝菌多糖得率有極顯著影響的是不同的微波時間和料液比，不同提取次數對多糖得率影響不顯著(表4)。

表3 粗網柄牛肝菌提取菌多糖正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal tests of Boletus ornatipes

表4 粗網柄牛肝菌提取菌粗多糖正交試驗方差分析表Table 4 The table of variance analysis of Boletus ornatipes，polysaccharides

2.2.2 最佳提取條件的驗證試驗

驗證試驗粗多糖得率平均為32.62±0.67(mg/g)，說明試驗工藝穩定性和重復性較好。

2.3 粗網柄牛肝菌粗多糖抗氧化能力的檢測

粗網柄牛肝菌粗多糖質量濃度為0.25 mg/mL時的抑制率為96.06%，說明粗網柄牛肝菌粗多糖存在較強的抗氧化活性 (表5)。

表5 粗網柄牛肝菌粗多糖與Vc抗氧化抑制率比較Table 5 Antioxidant inhibitory rate of Boletus ornatipes，polysaccharides compared with Vc

3.討論與結論

3.1 就三種提取方法來說微波法優于其他兩種方法在料液比相同的情況下，微波提取方法的多糖得率是熱水浸提法的1.12倍，是超聲波法的1.4倍。這可能得益于高頻率的電磁波能夠較好的穿透入物體的深處，從而導致細胞破裂，胞內有效成分流出，從而容易進入提取溶劑。

3.2 選擇微波法作正交試驗，從正交試驗結果得出最佳提取工藝為微波時間6min、料液比1∶60，提取次數3次，多糖得率高達31.93mg/g。從表6知道料液比和微波時間 (0.01＜P＜0.5)對粗網柄牛肝菌多糖的提取有極顯著的影響，而提取次數 (P＜0.01)對其沒有顯著地影響，這是因為第一次提取就已經提取出大部分多糖，再多提取幾次也只是獲得了相當少的多糖，這一點對以后大規模工廠化生產多糖具有重要的參考價值，工廠可以參考這一點從而在最少提取次數，花費最少的人力、物力下獲得最大多糖得率。而料液比和微波時間對獲得多糖有顯著的影響，所以要獲得更高的多糖得率可以從料液比和微波時間選擇上下功夫，探索出能獲得最大多糖得率的最佳方法。

3.3 羥基自由基反應性極強，對機體的破壞作用最大，可以導致各種疾病的發生和機體的衰老，用云南野生菌粗網柄牛肝菌粗多糖進行抗氧化性試驗得出，其粗多糖有抗氧化的能力，且在一定濃度范圍內，粗網柄牛肝菌抗氧化的能力隨著不同的濃度升高，其菌多糖抗氧化的能力是其藥用價值的基礎。可以考慮將粗網柄牛肝菌作為抗氧化劑應用于食品和保健食品。

3.4 測定多糖含量是根據在其生成物的最大吸收峰的吸光度值來定量測定的，野生菌所含色素會影響測定值的大小。多糖測定過程中，不同的脫色方法對多糖的測定的含量影響很大，陶美華的研究表明，過氧化氫的脫色效果比活性炭好，但是過氧化氫脫色會使多糖嚴重損失，這是得不償失的。［8］所以本實驗選活性炭作為脫色劑是科學的。

［1］張春霞，紀開萍，何明霞，等.暗褐網柄牛肝菌子實體營養成分分析［J］.云南大學學報(自然科學版)，2010，6:702—704.

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［3］Umehara S，Fujiwara H，Shiozaki A，et al.PSK induces apoptosis through the inhibition of activated STAT3 in human esophageal carcinoma cells［J］.Int Joncol，2012，4l(1):61—6.

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［7］李麗，劉質凈，時東方，等.車前草中苯乙醇苷類化合物的抗氧化活性研究［J］.江蘇農業科學，2010(1):275—277.

［8］陶美華，潘清靈，章衛民.藥用真菌多糖含量測定方法研究［J］.中國食用菌，2005，24(5):37—38.