5種大黃制劑微生物限度檢查法的建立

李 思 方 李 吳晶晶 陸 崟 蘇 華 王曙東

南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇南京 210002

《中國藥典》（2010年版）[1]強調對藥品的微生物限度檢查法進行方法學驗證，南京軍區南京總醫院制劑科（以下簡稱“我科”）制劑以中藥為主，多種中藥材和中藥單體化合物有不同程度的抑菌性，本研究以大黃制劑為例，目的是建立對抑菌性較強中成藥的微生物限度檢查方法，驗證過程中當采用常規法不能真實反映制劑微生物污染情況時，應采用培養基稀釋法或薄膜過濾法等方法先消除供試品中的抑菌活性，再進行微生物限度檢查，以有效控制制劑質量。微生物限度檢查是控制制劑質量的一項重要指標，制劑質量控制是制劑生產銷售的關鍵，所以針對不同類型制劑建立安全有效的微生物限度檢查法對控制我科制劑的安全性有著至關重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫細菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；ML160型霉菌培養箱 （上海躍進醫療器械廠）。

1.2 樣品

選取我科自制制劑保腎片、新保腎片、腎炎寧片、新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊，每種制劑選取近期的3個批次作為驗證樣品。

保腎片（批號:141230、150126、150202），新保腎片（批號:141227、150114、150128），腎炎寧片（批號:141223、150118、150210），新腎炎膠囊（批號:141230、150116、150204），炎黃保腎膠囊（批號:150112、150126、150209）均由我科提供。

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[編號 CMCC（B）26003第 3代]，枯草芽孢桿菌[編號 CMCC（B）63501第 4代]，大腸埃希菌[編號 CMCC（B）44102 第 4 代]，白色念珠菌[編號CMCC（F）98001 第 3 代]，黑曲霉[編號 CMCC（F）98003第3代]均由江蘇省食品藥品檢驗所提供。

1.4 培養基

營養瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130513），玫瑰紅鈉瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:141010），營養肉湯培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130311），膽鹽乳糖培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:140212），MUG培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130307），改良馬丁培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130830），改良馬丁瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130923）均由江蘇省食品藥品檢驗所提供。按規定進行的適用性檢查結果合格。稀釋劑為pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗劑為0.1%蛋白胨（規格:250 g，北京三藥科技開發公司，中國藥品生物制品檢定所監制，批號:130814）。

2 方法與結果

按《中國藥典》（2010年版）[1]一部附錄微生物限度檢查法進行驗證。

2.1 菌液制備[2]

2.1.1 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌

用陽性菌專用接種環取適量金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌新鮮培養物置已滅菌的10 mL營養肉湯培養基中，將接種這3株菌的培養基置于細菌培養箱（30～35℃）中培養 18～24 h，分別取各培養物1 mL加至0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL中，金黃色葡萄球菌10倍遞增稀釋至1/106，大腸埃希菌10倍遞增稀釋至1/10-7，枯草芽孢桿菌10倍遞增稀釋至1/105，分別制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌

用陽性菌專用接種環取適量白色念珠菌的新鮮培養物置已滅菌的10 mL改良馬丁培養基中，將接種好的培養基置于霉菌培養箱（23～28℃）中培養36～48 h，取培養物1 mL加至0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL中，10倍遞增稀釋至1/105，制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉

用陽性菌專用接種環取適量黑曲霉新鮮培養物置于改良馬丁瓊脂斜面培養基中，將接種好的培養基置于霉菌培養箱（23～28℃）中培養7 d，形成大量孢子，洗脫孢子過濾，取1 mL孢子液，制成孢子懸液，使之每毫升含孢子數為50～100 cfu。

2.2 供試液制備

取供試品（5種制劑每種各3個批次）10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶10均勻混懸液作為供試液備用。

2.3 回收率測定

細菌、霉菌和酵母菌計數檢查方法的建立:若試驗組的菌回收率均不低于70%，可按該供試液制備方法和計數方法測定供試品的細菌、霉菌和酵母菌數；若任一次平行試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應建立新的方法，并重新驗證。

2.3.1 常規法[3]

2.3.1.1 試驗組 分別取上述5種制劑各3個批號的供試液（1∶10）1 mL，注入 10 個平皿中，2 個一組分為5組，每組分別加入上述稀釋的5種菌懸液1 mL（50～100 cfu），每株試驗菌平行制備2個平皿，細菌傾注營養瓊脂培養基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養 72 h。

2.3.1.2 菌液組 取10個平皿，2個一組分成5組，分別取上述稀釋的5種菌懸液1 mL注入每組平皿中，每個菌平行制備2個平皿，細菌傾注營養瓊脂培養基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養72 h，測定所加入的試驗菌數。

2.3.1.3 供試品對照組 每種培養基制備2個平皿，分別取上述5種制劑各3個批號的供試液 （1∶10）1 mL分別注入，傾注培養基，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養72 h，以測定供試品的本底菌數。

2.3.1.4 稀釋劑對照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設置該組。

2.3.1.5 驗證結果 依照下列公式，計算常規法項下5種大黃制劑的試驗菌回收率:

由表1可知，5種大黃制劑對枯草芽孢桿菌均有很強的抑菌作用，均需改用培養基稀釋法或薄膜過濾法重新驗證；新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對金黃色葡萄球菌有很強的抑菌作用；腎炎寧片、新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對白色念珠菌有一定的抑菌作用；保腎片和新保腎片對白色念珠菌及黑曲霉均無抑制作用，回收率均達到70%以上，故可采用常規法測定這2個品種的霉菌和酵母菌數。

表1 常規法項下5種大黃制劑的試驗菌回收率（%）

2.3.2 培養基稀釋法[4-5]

2.3.2.1 試驗組 分別取上述5種制劑各3個批號的供試液（1∶10）0.2 mL 置于 10個平皿，2個一組分成5組，每株試驗菌平行制備2個平皿，即供試液每平皿0.2 mL，依次加入上述稀釋的5種菌懸液1 mL（50～100 cfu），細菌傾注營養瓊脂培養基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養72 h。

2.3.2.2 菌液組 取10個平皿，2個一組分成5組，每個菌平行制備2個平皿，分別取上述稀釋的5種菌懸液1 mL注入每組平皿中，細菌傾注營養瓊脂培養基，霉菌和酵母菌傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養72 h，測定所加入的試驗菌數。

2.3.2.3 供試品對照組 分別取上述5種制劑各3個批號的供試液0.2 mL置4個平皿中，營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基每種培養基制備2個平皿，即供試液每平皿0.2 mL，待凝固后，營養瓊脂培養基置細菌培養箱（30～35℃）培養48 h，玫瑰紅鈉瓊脂培養基置霉菌培養箱（23～28℃）培養72 h，以測定供試品的本底菌數。

2.3.2.4 稀釋劑對照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設置該組。

2.3.2.5 驗證結果 依照下列公式，計算培養基稀釋法項下5種大黃制劑的試驗菌回收率:

由表2可知，經培養基稀釋（每平皿0.2 mL），保腎片、新保腎片和腎炎寧片3個品種對5株試驗菌的回收率均高于70%，證明無抑菌作用。新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌作用較強，采用培養基稀釋法不能完全消除其抑菌作用，需改用薄膜過濾法重新驗證；對白色念珠菌和黑曲霉已無抑制作用，回收率均70%以上，可采用培養基稀釋法測定。

2.3.3 薄膜過濾法[6]

2.3.3.1 試驗組 分別取上述新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊各3個批次的供試液（1∶10）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過濾器中，經減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，在最后一次沖洗液中依次加入上述稀釋的細菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的菌懸液 1 mL（50～100 cfu），抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營養瓊脂培養基上，置細菌培養箱（30～35℃）培養 48 h。

表2 培養基稀釋法項下5種大黃制劑的試驗菌回收率（0.2 mL/皿，%）

2.3.3.2 菌液組 分別取上述稀釋的細菌菌液（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過濾器中，經減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營養瓊脂培養基上，置細菌培養箱（30～35℃）培養 48 h。

2.3.3.3 供試品對照組 分別取上述新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊各3個批次的供試液（1∶10）1 mL，加入裝有100 mL沖洗液的過濾器中，經減壓抽濾，每次約100 mL沖洗，共沖洗300 mL/膜，抽濾干凈后取膜，菌面向上貼于凝固的營養瓊脂培養基上，置細菌培養箱（30～35℃）培養 48 h。

2.3.3.4 稀釋劑對照組 本品未用特殊方法處理和制備，所以未設置該組。

2.3.3.5 驗證結果 依照下列公式，計算薄膜過濾法項下2種大黃制劑的試驗菌回收率:

由表3可知，經薄膜過濾后，新腎炎膠囊和炎黃保腎膠囊對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，證明已無抑菌作用，可采用薄膜過濾法對這2個品種進行細菌計數檢查。

2.4 控制菌檢驗方法驗證

2.4.1 試驗組

分別取上述5種制劑的供試液（1∶10）10 mL及92 cfu的大腸埃希菌，加入100 mL的膽鹽乳糖增菌培養基中，置 30～35℃培養箱 18～24 h，取上述培養物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養基的試管內培養，于5、24 h在366 nm紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。

表3 薄膜過濾法項下2種大黃制劑的試驗菌回收率（%）

2.4.2 陰性菌對照組

分別取上述5種制劑的供試液（1∶10）10 mL及93 cfu的金黃色葡萄球菌，加入100 mL的膽鹽乳糖增菌培養基中，置 30～35℃培養箱18～24 h，取上述培養物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養基的試管內培養，于5、24 h在366 nm紫外燈下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。

2.4.3 驗證結果

由表4可見，采用常規法，控制菌（大腸埃希菌）能正常檢出，陰性對照未檢出金黃色葡萄球菌，符合《中國藥典》（2010年版）微生物限度檢查驗證要求，所以常規法可用于這5種大黃制劑的控制菌檢查。

表4 控制菌（大腸埃希菌）驗證結果

2.5 微生物限度檢查法建立

根據以上試驗驗證結果，建立5種大黃制劑的微生物限度檢查法，結果見表5。

表5 5種大黃制劑微生物限度檢查法

3 討論

我國具有大量寶貴的中藥資源，而中草藥在生長過程中不斷與細菌抗爭，逐漸成為天然的抑菌藥物[7]，中成藥中含有較強抑菌成分時，要先排除抑菌成分的干擾[8]，才能真實反映制劑污染微生物的狀況，有研究報道過大黃與其他多種藥材的抑菌性[9]，大黃的抑菌作用相對都較強[10-11]，所以建立大黃制劑微生物限度檢查法時，必須先消除其抗菌性，才能正確反映制劑的微生物污染情況。

本研究選取的5種制劑均以大黃藥材提取物為主要成分，大黃主要含蒽醌類化合物，主要包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，為大黃發揮抗菌作用的主要成分[12]，尤其對金黃色葡萄球菌和鏈球菌等均有較強的抑制作用，5種制劑中保腎片、新保腎片和腎炎寧片含量測定以大黃酸、大黃素和大黃酚為主[13-14]，新腎炎膠囊含量測定以大黃素為主，炎黃保腎膠囊含量測定以大黃酸為主。試驗結果表明，5種大黃制劑中所含大黃蒽醌類成分含量不同，發揮抑菌作用效果也不同，含量愈高，抑菌作用也愈強。在對同一種中藥原料制劑進行微生物限度檢查時，由于所含主要成分差異以及含量高低而導致抑菌作用不同，故排除抑菌干擾所采取的方法也不同，應根據試驗結果建立準確合適的微生物限度檢查方法以保證制劑質量。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄79-附錄88.

[2]賓馳，顏棟林.4種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].中國醫藥指南，2011，9（22）:226-228.

[3]黃英.14種中成藥微生物限度檢查方法研究[J].中國執業藥師，2013，10（2）:27-30.

[4]方李，張心悅，吳晶晶，等.13種軟膏劑微生物限度檢查的方法驗證討論[J].研究簡報，2014，17（9）:1580-1583.

[5]方李，吳晶晶，錢琳娜，等.急支平喘軟膠囊微生物限度檢查的方法驗證[J].安徽醫藥，2013，17（1）:35-36.

[6]于風平，楊美琴，特玉香，等.含大黃、黃芩、黃連和黃柏藥材的中成藥微生物限度檢查法的建立[J].藥物分析雜志，2010，30（3）:558-562.

[7]李亞娜.中藥抑菌的研究現狀及思考[J].國際檢驗醫學雜志，2014，35（2）:198-200.

[8]梁勤，喬登嫣，馬小明，等.甘肅道地中藥大黃、黃芩對多重耐藥菌的抑菌活性[J].西部中醫藥，2014，27（5）:5-7.

[9]費娜，楊俊杰.大黃等四種中草藥體外抑菌活性比較[J].黑龍江醫藥科學，2010，33（1）:18-19.

[10]宋麗琴.大黃不同炮制品的體外抑菌作用[J].海峽藥學，2011，23（5）:55-56.

[11]陳子彬，豐浩榮，王祥和.烏司他丁聯合大黃對創傷后急性肺損傷的治療效果[J].解放軍醫藥雜志，2015，27（2）:69-72.

[12]彭苑霞，劉曉強，溫羚玲，等.大黃等5味中藥及單體成分對臨床多重耐藥菌的抑制作用[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（22）:103-107.

[13]陸崟，王銀娟，廖欣，等.腎炎寧片穩定性考察[J].安徽醫藥，2013，17（2）:191-193.

[14]王曙東，喬立業，方李，等.保腎片的質量標準研究[J].研究論文，2014，17（8）:1300-1302.