熊果酸誘導慢性粒細胞白血病細胞凋亡過程中活性氧的生物學功能探討

費選文　張蘇偉　孟令英

[摘要] 目的 研究熊果酸對慢性粒細胞白血病細胞株K562的凋亡及其過程中活性氧自由基的作用。 方法 不同濃度UA處理后用顯微鏡觀察K562細胞的形態學變化；用Annexin V/PI雙染色法檢測凋亡；用DCFH-DA法檢測活性氧自由基的水平。 結果 20μmol/L濃度組可見細胞變形、壞死，40μmol/L濃度組可見細胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現象。10、20、40μmol/L作用48h后K562細胞凋亡呈劑量依賴關系，凋亡率分別為21.66%、40.55%、70.21%，隨著UA濃度的增高細胞凋亡率也增高，差異具有統計學意義（P<0.01）。熊果酸能顯著增高K562細胞內的活性氧水平，且活性氧水平隨著熊果酸的濃度增加而升高。平均熒光強度由48.96升至78.23，差異具有統計學意義（P<0.01）。 結論 熊果酸可誘導慢性粒細胞白血病凋亡，且活性氧自由基的水平在凋亡誘導過程中起了重要作用。

[關鍵詞] 熊果酸；慢性粒細胞白血??；凋亡；活性氧自由基

[中圖分類號] R733.72 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）15-27-04

[Abstract] Objective To study the effect of UA on apoptosis of ROS cell line K562 and its process. Methods Different concentrations of UA treatment after microscope was used to observe the morphological changes of K562 cells； annexin V/PI double staining method for the detection of apoptosis； variations method was used to detect the reactive oxygen species （ROS） level. Results In the 20μmol/L concentration group， the deformation and necrosis of the cells were found， and the deformation of the cells was 40μmol/L. 10， 20， 40μmol/L for 48h after apoptosis of K562 cells was dose dependent， the apoptosis rate was 21.66%， 40.55%， 70.21%， with UA concentration increased cell apoptosis rate increased. The difference is statistically significant （P<0.01）. UA can significantly increase the level of reactive oxygen species in K562 cells， and the level of reactive oxygen species increases with the increase of UA concentration. The average fluorescence intensity was 48.96 to 78.23， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion UA can induce the apoptosis of chronic myeloid leukemia， and the level of reactive oxygen species plays an important role in the process of apoptosis induction.

[Key words] UA； Chronic myeloid leukemia； Apoptosis； Reactive oxygen species

熊果酸（UA）屬于五環三萜類化合物，廣泛分布于自然界中[1-5]。UA對多種致癌和促癌物質均有不同程度的抵抗作用，并且能夠抑制多種實體腫瘤細胞的生長[1-5]。Ning等[6]（2012年）探討了來源于髓系的人白血病細胞U937中由UA誘導的細胞凋亡過程，結果表明，PKB失活和JNK活化在UA引起的細胞凋亡中發揮著重要的作用。活性氧自由基（ROS），包括H2O2和超氧化物自由基，引起細胞的氧化應激，這正是內源性凋亡途徑的啟動因素，如Azhar等[7]（2011年）發現，在人白血病細胞株THP-1中，化合物誘導的凋亡與ROS的生成及JNK激活有關，用NAC抑制ROS的產生可以抑制JNK信號激活及凋亡，這說明正是ROS水平的增高引起上述過程。

本文通過UA誘導K562細胞凋亡，針對性檢測ROS這一關鍵分子靶點，探討ROS在UA誘導K562細胞凋亡過程中的作用，為UA臨床應用積累有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

慢性粒細胞白血病細胞株K562以及熊果酸由汕頭大學醫學院中心實驗室惠贈；RPMI-1640購自GIBCO；Annexin V/PI、DCFH-DA熒光染料購自Sigma公司。

1.2 細胞培養與分組

K562細胞在含10%胎牛血清和100U/L青霉素以及100U/L鏈霉素的RPMI-1640培養基里懸浮培養。取1×106個/mL濃度的細胞分四組，分別以0、10、20、40μmol/L UA作用48h。endprint

1.3 細胞形態觀察

取對數生長期各組K562細胞，接種于培養瓶，48h后分別加入10、20、40μmol/L濃度的UA，處理48h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍攝記錄細胞形態。

1.4 細胞凋亡檢測

收集四組處理后的細胞，1500rpm離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞并計數。取1×106個重懸的細胞，1500rpm離心5min后棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。再加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫（20～25℃）避光孵育10min。1500rpm離心5min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細胞儀檢測。

1.5 細胞內ROS水平檢測

DCFH-DA自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在的情況下被氧化成DCF，后者的熒光強度與細胞內活性氧水平成正比。收集處理后1×106個/mL細胞懸液，PBS洗滌后，加入1mL Hanks液重懸，加入2.5mmol/L的CDFH-DA液40μL，使終濃度為100μmol/L，在37℃下避光孵育1h，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測。

1.6 統計學處理

使用統計學軟件SPSS19.0軟件進行數據分析，熊果酸誘導凋亡及ROS水平試驗檢測數據用（）表示，兩兩比較使用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態變化

10μmol/L濃度組整個時間段細胞形態變化不明顯；20μmol/L濃度組可見少許細胞變形、壞死，隨著時間的延長變形、壞死的細胞有增多趨勢；40μmol/L濃度組可見細胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現象。見圖1。

2.2 UA誘導K562細胞凋亡

不同濃度組的UA作用K562細胞后，應用流式細胞儀檢測各組的細胞凋亡率。結果表明，UA作用K562細胞48h后，隨著UA濃度的增高細胞凋亡率也增高，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.3 UA降低K562細胞內ROS水平

不同濃度組的UA作用K562細胞后，應用流式細胞儀檢測各組的細胞內ROS水平。結果表明，UA作用K562細胞48h后，隨著UA濃度的增高細胞內ROS水平呈升高趨勢，差異有統計學意義（P<0.01）。見表2。

3 討論

慢性粒細胞白血病是一種侵襲血液及骨髓的血液系統惡性腫瘤，它以產生大量的不成熟白細胞為主要特點，這些不成熟的白細胞在骨髓內聚集，抑制正常的骨髓造血功能，并且通過血液循環在全身擴散，導致機體出現貧血、出血傾向、感染及器官浸潤等癥狀[8-16]。

細胞凋亡是維持機體細胞數量動態平衡的主要方式，凋亡機制的紊亂是腫瘤發生的重要原因，誘導腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤的重要手段，同時也是臨床上腫瘤治療研究的熱點之一。

本研究結果顯示，UA 10μmol/L濃度組整個時間段細胞形態變化不明顯；20μmol/L濃度組可見少許細胞變形、壞死，隨著時間的延長變形、壞死的細胞有增多趨勢；40μmol/L濃度組可見細胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現象。UA作用K562細胞48h后，隨著UA濃度的增高細胞凋亡率也增高，差別具有統計學意義（P<0.01）。

UA是一種新近發現的治療白血病中藥，是五環三萜類化合物中的一個代表性藥物。有研究表明UA可以通過誘導白血病細胞凋亡來實現殺傷白血病細胞的目的，在誘導凋亡的過程中需要細胞內的氧自由基的參與[17]。五環三萜類化合物的抗腫瘤作用機理非常復雜，研究者們試圖從不同的方向解析其機制，很難對此類各種不同的化合物效應歸納出一個通用的作用模式，但是近年來的發現逐漸形成一個統一的主題：它們啟動了細胞內源和外源的兩種凋亡途徑，誘導細胞凋亡。

外源性凋亡途徑是由細胞表面的死亡受體的激活所啟動的，在多種癌細胞中五環三萜類化合物celastrol南蛇藤素增加腫瘤壞死因子（TNF）死亡受體家族的死亡受體4（DR4）的表達[18]。內源性凋亡途徑又稱作線粒體凋亡途徑，研究表明，在伊馬替尼耐藥細胞株KBM5中CDDO-Me主要是通過線粒體凋亡途徑誘導細胞調亡，低濃度的CDDO-Me抑制線粒體ROS的消耗，而細胞毒性效應則是伴隨迅速有選擇性地使GSH下降，ROS升高。

ROS是真核生物有氧呼吸的產物包括H2O2和超氧化物自由基等，可以引起細胞的氧化應激。ROS具有反應活性高、能快速與胞內大分子物質起反應的特點，可以引起細胞內結構的病理性損傷。然而，細胞內存在抗氧化酶類，拮抗這類物質的氧化損傷，清除細胞正常代謝過程中產生的ROS物質，使得細胞內的ROS的產生和清除處于一個動態平衡。研究表明ROS可以介導細胞內的信號轉導，激活相關的轉錄因子，從而引起相關的生物基因表達，起到調節細胞生長、增殖和凋亡的生物學功能。當細胞內ROS的動態平衡被破壞時，細胞就會受到氧化損傷，甚至死亡[19]。大量的研究證實ROS是細胞凋亡的重要信號通路之一[20]。本研究結果顯示，10μmol/L的UA就可使K562細胞內的ROS水平顯著升高，并且隨著ROS濃度的增高ROS水平也增高，與對照組相比具有統計學意義，并可能由此激活相對應的效應機制從而引發細胞凋亡。因此，刺激細胞內產生ROS從而誘導細胞凋亡可能是UA誘導K562細胞凋亡的重要機制。

綜上所述，ROS可以誘導K562細胞產生凋亡。其可能的凋亡信號通路為：UA作用于K562細胞引起細胞內的ROS水平升高，繼而產生細胞的氧化損傷，激活相關的凋亡機制從而誘導細胞產生凋亡。

[參考文獻]endprint

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（收稿日期：2015-05-25）endprint