鹽法提取豌豆分離蛋白凝膠特性及影響因素

單宏

（黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，黑龍江哈爾濱150086）

鹽法提取豌豆分離蛋白凝膠特性及影響因素

單宏

（黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，黑龍江哈爾濱150086）

采用一種低變性的提取方法——鹽法提取豌豆分離蛋白并使用流變儀測定其流變特性，結果表明：鹽法豌豆分離蛋白最低凝膠形成質量濃度是5.5g/100mL，豌豆分離蛋白凝膠點與蛋白質量濃度無相關性。豌豆分離蛋白凝膠點隨加熱速率增加呈上升趨勢。較高的加熱和冷卻速率能夠增加反應終點儲能模量（G'）和耗能模量（G”）值，因而降低凝膠強度。鹽法豌豆分離蛋白凝膠韌性隨蛋白質量濃度的增加而增大，且蛋白質量濃度與G'、G”值之間存在乘冪規律。tanδ值隨蛋白質量濃度升高而降低，當蛋白質量濃度高于5g/100mL時，弱凝膠開始形成；當蛋白質量濃度高于7g/100mL時，tanδ值幾乎保持恒定，表明凝膠彈性在此范圍內基本恒定。比較鹽法和商業豌豆分離蛋白凝膠性質后發現：鹽法豌豆分離蛋白具有更好的凝膠性。

豌豆分離蛋白；鹽法提取；凝膠；凝膠點；最低凝膠質量濃度；加熱冷卻速率；鹽濃度

傳統上豌豆一直作為蔬菜食用，近年來豌豆深加工有了一定發展，人們期待用豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）替代大豆蛋白用于肉制品乳化，然而與大豆蛋白相比，豌豆分離蛋白只能形成弱凝膠［1］，使其作為大豆蛋白替代品受到一定限制。目前對豌豆分離蛋白的凝膠性質研究較少，因此深入開展豌豆分離蛋白凝膠特性研究，進而開發可替代大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的豌豆分離蛋白，可為豌豆深加工探索新的出路，提升我國豌豆生產加工企業的經濟效益。

許多植物蛋白都是球蛋白［2］，蛋白凝膠的形成是由無定形溶液轉化為三維彈性網狀結構的過程［1］。球蛋白要形成交聯成網狀的凝膠，就必須要打開其球狀結構。因而可以預期任何能夠打開球蛋白結構，使包埋在其中的活性基團暴露的處理都可以改善植物蛋白的交聯能力［2］。加熱處理可使豌豆分離蛋白產生部分變性，打開其球狀結構，促進蛋白產生交聯，形成三維結構的凝膠［1］。

小張力振蕩動態測試（small strain oscillatory dynamic testing）因其對樣品物理結構和化學組分的變化特別敏感而在評估凝膠性質和凝膠強度方面有較大的應用價值［3］，近年來在對食品凝膠體系評價中應用逐漸增多。該方法測試過程中溫度變化梯度很小，通過對溫度的掃描可以記錄下與流變性質相關的從液體到膠體的能量轉化過程細節。可將動態流變測試或小張力凝膠強度測試用于研究熱誘導的植物蛋白凝膠形成過程，這種方法適于測量與凝膠形成現象相關的細微變化［4］。采用小張力振蕩動態測試原理的流變儀可測試熱誘導的豌豆分離蛋白凝膠體系并獲得較好的結果。

儲能模量（G'）是對正弦剪切變形的每一循環能量恢復的測量，其增量代表了與彈性凝膠結構相關的樣品的硬度［5］。G'的變化可以用于監測豌豆分離蛋白的凝膠過程。高儲能模量（G'）值表示凝膠體系中較強的分子間網絡結構及增強的蛋白-蛋白和蛋白-多聚物分子之間的相互作用，而較低的tanδ（G”/G'）值表示彈性更強的網絡結構［6］。加熱會引起蛋白質懸濁液產生由溶膠到凝膠的轉化，這是隨著儲能模量G'值的快速增大并最終與耗能模量值（G”）形成交叉，交叉點為G'值開始大于G”時，這個點的溫度即為凝膠的起始點，即文獻［7-10］中最常提到的G'-G”交叉點。

本實驗研究了鹽法提取豌豆分離蛋白熱誘導凝膠性質以及加熱和冷卻速率、鹽濃度和蛋白質量濃度對凝膠性的影響，并與商品豌豆分離蛋白和商品大豆分離蛋白進行比較，旨在探索鹽法豌豆分離蛋白應用于乳化肉制品的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

商業豌豆粉（蛋白質含量大于25%）大連嘉昱食品有限公司。

豌豆分離蛋白（蛋白質含量為大于82%）煙臺東方蛋白科技有限公司；PRO-FAM974商業大豆分離蛋白（蛋白質含量為90%）美國Archer Daniels Midland（ADM）公司。

1.2儀器與設備

TA2000流變儀美國TA公司；Vortex Genie Mixer振蕩混合器美國Scientific Industries公司；AXGL10M高速大容量冷凍離心機上海趙迪實驗室離心機公司；K2300自動凱氏定氮儀瑞典FOSS公司。

1.3方法

1.3.1鹽法豌豆分離蛋白提取程序

鹽法豌豆分離蛋白提取步驟為：

200g豌豆粉+800mL0.3mol/L NaCl→攪拌60min→離心（5000r/min，20min）→收集上清液→上清液與蒸餾水按1∶2混合→在5℃冰箱中靜置2h→離心（2000r/min，15min）→收集沉淀→與少量蒸餾水混合攪拌→在透析袋中進行離子交換，在5℃冰箱中放置72h，每24h換一次蒸餾水→冷凍干燥

1.3.2蛋白質含量測定

采用凱氏定氮法，轉換系數為5.7［11］。

1.3.3樣品制備

按照實驗設計，將鹽法豌豆分離蛋白、商品豌豆分離蛋白、商品大豆分離蛋白與不同濃度的NaCl溶液混合以獲得需要的蛋白質含量和鹽濃度。為獲得均勻分散的懸濁液，樣品用振蕩混合器振蕩1min以保證分離蛋白完全分散，懸濁液的pH值為自然值6.2～6.3，待測。

1.3.4最低凝膠質量濃度測定

最低凝膠質量濃度測定采用O’Kane等［12］的方法并略加修改。分別配制5mL4～18g/100mL的鹽法豌豆分離蛋白懸濁液及8～20g/100mL的商品豌豆分離蛋白懸濁液。所有樣品均在95℃水浴鍋中加熱10min（在密封的試管中以防止水分蒸發）。將樣品在室溫下冷卻1h，在4℃存放過夜。第2天將試管倒置，24h后未流下液體的視為產生凝膠，從而確定最低凝膠質量濃度。

1.3.5流變學特性測定

取約1mL豌豆分離蛋白懸濁液置于流變儀的工作臺上（為避免測定期間樣品水分蒸發，可加入適量礦物油到上平板的凹槽中，然后覆蓋特殊金屬蓋以防止加熱期間樣品蒸干）。設定間隙高度為1.00mm。在加熱和冷卻速率實驗中，采取4個不同的加熱和冷卻速率：4、2、1、0.5℃/min，且每個測試加熱和冷卻速率保持相同。樣品首先在25℃平衡2min，然后在25～95℃溫度范圍內，以4、2、1、0.5℃/min的速率加熱至95℃，然后冷卻至25℃，最后在25℃進行頻率掃描。頻率掃描范圍為0.01～10Hz。實驗采用2次重復。除特別注明，所有處理均為蛋白質質量濃度14.5g/100mL，NaCl濃度0.3mol/L，加熱和冷卻速率均為2℃/min。

1.3.6凝膠點測定

采用G'和G”交叉點溫度為豌豆分離蛋白的凝膠點。

1.4統計分析

所有數據均進行顯著性分析，采用Graph Pad In Stat3.06進行Tukey’s檢驗，最低顯著水平設為0.05。

2　結果與分析

2.1最低凝膠質量濃度

Clark等［13］根據網絡結構形成前和形成過程中大分子聚合水平將多聚物凝膠區分為：1）由無序多聚物形成的凝膠，如卡拉膠、果膠、淀粉等；2）蛋白質凝聚，如熱變性球蛋白和由酶或化學反應引起的凝膠，凝膠網絡結構包括高密度和不靈活的粒子之間的特定作用。食品中常用于球蛋白凝膠的方法是加熱變性，可以導致蛋白質四級、三級和二級結構的變化。它使一個球蛋白分子變性，二個以上凝聚，更多的則會形成一個膠體網絡結構［13］。由球蛋白制備凝膠需要其蛋白質量濃度比果膠或成膠碳水化合物濃度高出一個數量級［14］。因此，較高的質量濃度是豌豆分離蛋白形成凝膠的一個必要條件。

與鹽法相比，堿溶酸沉法提取的豌豆分離蛋白會產生嚴重的變性，導致其凝膠能力下降。當豌豆分離蛋白質量濃度為14.5g/100mL時，與商品豌豆分離蛋白（堿溶酸沉法提取）相比，鹽法蛋白凝膠有著較高的G'和較低的tanδ值，可形成良好的凝膠，而商品豌豆分離蛋白只能形成極弱的凝膠，這是一種類似醬類的形態，彈性很差。

本實驗制備的鹽法豌豆分離蛋白質含量為81.91g/100g，最低凝膠質量濃度為5.5g/100mL，而商品豌豆分離蛋白的最低凝膠質量濃度為14.5g/100mL。與O’Kane等［12］報道的含有20～28g/100g豆球蛋白和61～67g/100g豌豆球蛋白的豌豆分離蛋白的熱誘導凝膠在中性條件下（pH7.1）的最低凝膠質量濃度（16g/100mL）十分接近。由于O’Kane等［12］提取豌豆分離蛋白的方法是等電點沉淀法，與商業豌豆分離蛋白提取方法相同，該法會導致嚴重的蛋白變性而降低其功能性。

2.2凝膠點

凝膠點是凝膠開始形成的初始點，以G'-G”交叉點作為凝膠點已獲得廣泛認可。Shimada等［15］依據凝聚點與蛋白質量濃度的相關性將蛋白劃分為凝聚型蛋白（與蛋白質量濃度相關）和凝膠型蛋白（與蛋白質量濃度不相關）兩類。因此凝膠型蛋白具有恒定的凝膠點。由表1可知，不同質量濃度豌豆分離蛋白凝膠點在83～86℃之間波動，顯示凝膠點與蛋白質量濃度不相關，推斷豌豆分離蛋白是凝膠型蛋白。由表2可知，隨加熱速率的提高，凝膠點亦有升高的趨勢。然而，在較高的加熱速率（2～4℃/min）時，規律不明顯。可見，在較低的加熱速率時，凝膠點與加熱速率相關；而在較高的加熱速率時，凝膠點與加熱速率無關。

表1　鹽法提取豌豆分離蛋白質量濃度對凝膠點的影響Table1Influence of protein concentration on gelling point

表2加熱和冷卻速率對凝膠點的影響Table2Influence of heating and cooling rate on gelling pointTable2Influence of heating and cooling rate on gelling point

2.3加熱速率和冷卻速率對凝膠G'的影響

圖1　加熱和冷卻速率對儲能模量G'的影響Fig.1Impact of heating and cooling rate on the development of storage modulus G'

由圖1可知，當以最大速率（4℃/min）加熱和冷卻時，測得的G'值小于較慢加熱和冷卻速率（0.5、1、

2℃/min）條件下測得的數值。說明在較高的加熱和冷卻速率下形成的凝膠需要較高的溫度才能達到與在較低的加熱和冷卻速率下形成的凝膠相同的彈性。此外，

0.5℃/min的G'值最大，這是因為較慢的加熱和冷卻速率可使蛋白分子有充足的時間重新排列成某種合理的順序因而增強了凝膠的韌性［16-18］。

2.4蛋白質量濃度對凝膠G'和G”的影響

圖2熱致變豌豆分離蛋白凝膠網絡的蛋白質量濃度與G'和G”之間的關系Fig.2Relationship between pea protein concentration and either G' 'or G”values for heat-induced networks

由圖2可知，隨著蛋白質質量濃度的增加，G'和G”值均增大。這很可能是因為隨蛋白質質量濃度的增加，豌豆分離蛋白交聯的機率亦增加，從而生成較強的凝膠。

以豌豆分離蛋白質量濃度（ρ）為橫坐標，G'、G”為縱坐標，對圖2中曲線進行擬合得到方程：G'=0.0002ρ6.2（R2=0.97）；G”=0.0006ρ5.0（R2=0.97）。在早期研究中，研究者發現增加蛋白質量濃度可增大G'和G”值［19-20］，G'與蛋白質量濃度和G”與蛋白質量濃度之間存在一個乘冪規律。Arntfield等［19］用類似的方法描述豌豆球蛋白的G'和其質量濃度之間關系，并獲得類似的乘冪規律。

圖3蛋白質量濃度對熱致變凝膠網絡tantanδ的影響Fig.3Effect of protein concentration on tanδfor heat-induced gel networks

凝膠過程也可以用測定振蕩期間應力——應變相角變化的方式進行監測，由G”/G'比率獲得的tanδ值可傳遞溶膠——凝膠的轉變信息。本研究中這一轉化過程發生在加熱階段。在加熱期間tanδ值越低表示凝膠的彈性越好。從實驗數據推斷豌豆分離蛋白網絡結構的形成在83℃以上開始（表1），形成了凝膠理想的機械性能。在較低振蕩頻率時固體膠的tanδ值大約為0.01，弱凝膠的tanδ值約為0.1［21］。理論上認為，如果δ =0°，這種物質就是理想的完全彈性凝膠，而δ=90°時，這種物質則是理想液體。

當受熱變性時，暴露在蛋白質分子表面的疏水性殘基會顯著增加。二硫鍵很可能會在蛋白質聚合的第一步形成。加熱導致分子間硫氫基——二硫化物的交換，使蛋白質分子產生聚合［22］。顯著降低的tanδ值表示彈性的增強。由圖3可知，當豌豆分離蛋白含量從4%升高到7%時，tanδ值迅速從0.98下降到0.17，然后在0.16～0.17之間波動，這表明當豌豆分離蛋白質量濃度高于5g/100mL時，弱凝膠開始形成。當蛋白質量濃度高于7g/100mL時，tanδ值幾乎保持恒定，表明凝膠彈性在此范圍內基本恒定。

2.5鹽濃度對鹽法提取豌豆分離蛋白凝膠特性的影響

由圖4可知，在鹽濃度為0mol/L時，G'值非常小，僅有0.35Pa，而tanδ值高達0.86，這表明與高鹽濃度（0.3～1.0mol/L）相比，形成的凝膠較弱。鹽濃度為0.1mol/L時，G'僅有0.61Pa，tanδ值卻下降到很低的水平（0.13），說明已形成了凝膠，此時有大量水析出，說明該鹽濃度條件下蛋白的持水力較差。觀察發現在0.1mol/L鹽濃度形成的凝膠其強度要比0.3mol/L以上鹽濃度形成的凝膠高，這與Catsimpoolas等［23］的研究報道相似。可能由于鹽濃度的增大利于在蛋白分子表面電荷形成屏蔽效應，導致蛋白分子間排斥力削弱，產生與等電區域相同的情形，因而形成強度較高的凝膠。而進一步增加鹽濃度會削弱纏繞成球狀的蛋白分子結構的打開，從而妨礙凝膠的形成［24］。

圖4NaCl濃度對豌豆分離蛋白凝膠性的影響Fig.4Effect of NaCl concentration on gelation properties of PPIs

由圖4可知，G'曲線上有2個峰值，一個在鹽濃度為0.4mol/L處，另一個在0.7mol/L處，表明在這兩個鹽濃度條件下，蛋白之間相互作用較強，形成了強度較高的凝膠。這可能是由于在這兩個鹽濃度條件下蛋白質分子之間具有較好的靜電平衡，從而形成較強的凝膠［25］。

圖5凝膠點與NaCl濃度的關系Fig.5Relationship between gelling point and NaCl concentration

另外，鹽濃度對凝膠點也有較大影響，如圖5所示，隨著NaCl濃度的增加，凝膠點呈升高趨勢。這可能是由于在較低的鹽濃度區間蛋白分子表面電荷形成屏蔽效應，導致蛋白分子間排斥力減弱［23］，因而能夠在較低溫度下開始形成凝膠；而隨著鹽濃度的增加，球狀蛋白質分子結構的打開受到抑制［24］，導致凝膠形成變得困難，因而凝膠點溫度提高。

2.6鹽法豌豆分離蛋白、商品豌豆分離蛋白和商品大豆蛋白凝膠性質比較

表3鹽法豌豆分離蛋白、商品豌豆分離蛋白和商品大豆蛋白的凝膠性質比較Table3Comparison of gelation properties of PPIs，PPIc，and SPIc

由表3可知，鹽法豌豆分離蛋白的凝膠G'（3212.51Pa）遠高于商品豌豆分離蛋白（349.54Pa）。這是因為商品豌豆分離蛋白采用等電點沉降法制得，豌豆分離蛋白因酸處理嚴重變性，導致凝膠性能顯著降低。

3　結論

球蛋白，如豌豆分離蛋白，能夠形成熱誘導凝膠，豌豆分離蛋白需要一定程度的變性以打開其纏繞的肽鏈、暴露出相關基團、進行交聯以產生形成凝膠的非共價鍵和二硫鍵。變性程度較低時，豌豆分離蛋白可形成較強的凝膠。影響豌豆熱誘導凝膠性質的因素中鹽濃度是最重要的。實驗結果顯示，最適鹽濃度大約為0.4、0.7mol/L，過高和過低的鹽濃度都會導致凝膠的弱化；較高的鹽濃度導致較高的凝膠點；蛋白質量濃度越高，凝膠韌性越大，然而凝膠點與蛋白質量濃度無關。實驗證實加熱速率也會影響凝膠點，較高的加熱速率使凝膠點升高；提高加熱和冷卻速率均會引起凝膠彈性的弱化。

鹽法提取豌豆分離蛋白是一種溫和的提取方法，可以極大減輕豌豆分離蛋白變性程度。用此方法提取的豌豆分離蛋白與等電點沉降法（商業方法）相比具有優良的凝膠能力。因此，鹽法提取豌豆分離蛋白可作為功能性蛋白添加劑應用于乳化肉制品中，具有良好的開發前景。

［1］O’KANE F E，HAPPE R P，VEREIJKEN J M，et al.Characterization of pea vicillin.2.Consequences of compositional heterogeneity on heat-induced gelation behavior［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（10）：3149-3154.

［2］NIELSEN P M.Reactions and potential industrial applications of transglutaminase.Review of literature and patents［J］.Food Biotechnology，1995，9（3）：119-156.

［3］WESTPHALEN A D，BRIGGS J L，LONERGAN S M.Influence of pH on rheological properties of porcine myofibrillar protein during heat induced gelation［J］.Meat Science，2005，70（2）：293-299.

［4］HAMANN D D.Methods for measuring rheological changes during thermally induced gelation of proteins［J］.Food Technology，1987，41（3）：100-108.

［5］EGELANDSDAL B，MARTINSEN B，AUTIO K.Rheological parameters as predictor of protein functionality：a model study using myofibrils of different fiber-type composition［J］.Meat Science，1995，39（1）：97-111.

［6］URUAKPA F O，ARNTFIELD S D.Impact of urea on the microstructure of commercial canola protein-carrageenan network network：a research note［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2006，38（2）：115-119.

［7］IKEDA S，NISHINARI K.On solid-like rheological behaviors of globular protein solutions［J］.Food Hydrocolloids，2001，15（4/6）：401-406.

［8］STADING M，HERMANSSON A M.Viscoelastic behavior ofβ-lactoglobulin structures［J］.Food Hydrocolloids，1990，4（2）：121-135.

［9］ROSS-MURPHY S B.Rheological characterisation of gels［J］.Journal of Texture Study，1995，26（4）：391-400.

［10］YOON W B，KIM B Y，PARK J W.Rheological characteristics of fibrinogen-thrombin solution and its effects on surimi gels［J］.Journal of Food Science，1999，64（2）：291-294.

［11］AACC.Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists［S］.

［12］O’KANE F E，VEREIJKEN J M，GRUPPEN H，et al.Gelation behaviour of protein isolates extracted from5cultivars of Pisum sativum L.［J］.Journal of Food Science，2005，70（2）：C132-C137.

［13］CLARK A H，ROSS-MURPHY S B.Structure and mechanical properties of biopolymer gels［M］//CLARK A H，ROSS-MURPHY S B.Advances in polymer science.Berlin Heidelberg：Springer，1987：57-192.

［14］TOMBS M P.Gelation of globular proteins［J］.Faraday Discussions of the Chemical Society，1974，57：158-164.

［15］SHIMADA K，MATSUSHITA S.Thermal coagulation of egg albumin［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1980，28（2）：409-412.

［16］ARNTFIELD S D，MURRAY E D.Heating rate affects thermal properties and network formation for vicilin and ovalbumin at various pH values［J］.Journal of Food Science，1992，57（3）：640-646.

［17］STADING M，LANGTON M，HERMANSSON A M.Microstructure and rheological behaviour of particulate beta-lactoglobulin gels［J］.Food Hydrocolloids，1993，7（3）：195-212.

［18］LI J，OULD ELEYA M M，GUNASEKARAN S.Gelation of whey protein and xanthan mixture：effect of heating rate on rheological properties［J］.Food Hydrocolloids，2006，20（5）：678-686.

［19］ARNTFIELD S D，MURRAY E D，ISMOND M A H.Dependence of thermal properties as well as network microstructure and rheology on protein concentration for ovalbumin and vicilin［J］.Journal of Texture Studies，1990，21（2）：191-212.

［20］van KLEEF F S M.Thermally induced protein gelation and rheological characterization of highly concentrated ovalbumin and soybean protein gels［J］.Biopolymers，1986，25（1）：31-59.

［21］ROSS-MURPHY S B.Rheological methods［M］//CHAN H W S.Biophysical methods in food researach.Oxford：Alden Press，1984：138-199.

［22］HERMANSSON A M.Aggregation and denaturation involved in gel formation［M］//POUR-EL A.Functionality and protein structure.Washington：American Chemical Society，1979：81-103.

［23］CATSIMPOOLAS N，MEYER E W.Gelation phenomena of soybean globulins.I.Protein protein interactions［J］.Cereal Chemistry，1970，47：559-570.

［24］BOYE J I，ALLI I，ISMAIL A A，et al.Factors affecting molecular characteristics of whey protein gelation［J］.International Dairy Journal，1995，5（4）：337-353.

［25］RENKEMA J M S，LAKEMOND C M M，de JONGH H H J，et al.The effect of pH on heat denaturation and gel forming properties of soy proteins［J］.Journal of Biotechnology，2000，79（3）：223-230.

Gel-Forming Characteristics of Pea Protein Isolate and Their Affecting Factors

SHAN Hong（Safety and Quality Institute of Agricultural Products，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin150086，China）

A novel low-denaturation extraction method，salt method，was applied to extract pea protein isolate from commercial pea flour and the gelation characteristics of this protein isolate were determined by a rheometer.The minimum gelation concentration of salt extracted pea protein isolate（PPIs）was5.5g/100mL.No correlation was noted between the gelation point and concentration of PPIs，but the gelling point showed a tendency of increasing with heating rate.Meanwhile，higher heating and cooling rates resulted in decreased final G'（storage modulus）and G”（loss modulus），thus reducing the gel stiffness.Higher protein concentration induced greater gel stiffness，and higher G'and G”values.It was found that there were power law relationships between protein concentration and either G'or G”values.Tan delta value decreased with increasing protein concentration，and weak gel was formed when protein concentration was greater than5g/100mL；however，when protein concentration was greater than7g/100mL，tan delta kept almost constant，which indicated that gel elasticity was constant within this concentration range.When comparing gelation properties of PPIs to commercial pea protein isolate（PPIc），the gel stiffness of PPIs was much greater than that of PPIc.Therefore，PPIs may have greater market prospect than PPIc in emulsified meat products.

pea protein isolate；salt extraction；gelation；gelling point；minimum gelation mass concentration；heating and cooling rate；salt concentration

TS252.53

A

1002-6630（2015）05-0072-05

10.7506/spkx1002-6630-201505014

2014-05-11

單宏（1971—），女，副研究員，碩士，研究方向為農產品功能性評價。E-mail：ningjing8139@sina.com