沙門氏菌噬菌體STP4-a重組內溶素抑菌特性分析

林洪，李萌，王靜雪*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

沙門氏菌噬菌體STP4-a重組內溶素抑菌特性分析

林洪，李萌，王靜雪*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

為研究內溶素重組蛋白LysSTP4對沙門氏菌的抑菌性能，采用擴散法和濁度法探討不同pH值、溫度、離子強度等條件對其裂解穩定性的影響。結果表明，LysSTP4在pH 5～10和溫度30～50 ℃的條件下均能保持較高的活性，在-80 ℃條件下保存6 個月仍有85%的殘留酶活力，與膜通透劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）協同作用能夠有效抑制高濃度沙門氏菌的生長。

沙門氏菌；烈性噬菌體；內溶素

沙門氏菌為革蘭氏陰性直桿菌，是一種重要的人畜共患病原菌。在國內外，由沙門氏菌引起的食源性疾病發生率一直位于前列[1]。隨著抗生素的大量和長期使用，越來越多的沙門氏菌產生了耐藥性[2-3]。Pan Zhiming等[4]對我國境內1962—2007年中分離得到的Salmonella Pullorum進行耐藥性檢測，發現39%～95%的細菌對氯霉素、甲氧芐啶、氨芐青霉素等常用來治療沙門氏菌感染的首選藥物具有耐藥性，超過56%的細菌具有多重耐藥性，而且在1970—1979年和2000—2007年中有明顯的耐藥性增長趨勢。因此，研究能夠用于替代化學抗生素進行有效沙門氏菌防治的生物綠色抑菌劑具有非常重大的意義。

噬菌體內溶素是一類能夠裂解細菌細胞壁的裂解酶[5]。盡管在1957年噬菌體內溶素裂解細菌的能力就被首次報道，但直到2001年Nelson等[6]才證實純化的重組內溶素可以作為抗菌劑有效控制大鼠感染A族鏈球菌（group A streptococci）。到目前為止，內溶素已被用來防控和檢測食品中的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌和梭狀芽孢桿菌[7-9]。另有研究指出與使用小分子抗生素或噬菌體顆粒用于抗菌治療或預防相比，專一性的噬菌體內溶素不易導致抗性菌株的快速出現[10]。隨著克隆表達技術的成熟，國內外關于重組內溶素的報道越來越多，這些研究結果表明內溶素重組蛋白易于生產、易于工程改造并且仍具有一定的裂解專一性[11-16]。因此，內溶素作為新型抗菌劑具有一定的優勢。

在前期的工作中，本實驗室分離得到一株新型廣譜的T4型沙門氏菌噬菌體STP4-a，通過對STP4-a全基因組測序和分析得知gp193編碼的蛋白為糖苷酶類型的內溶素，通過克隆表達純化，獲得內溶素重組蛋白。在本實驗中將分析該內溶素的裂解性能，為沙門氏菌噬菌體內溶素及其他革蘭氏陰性噬菌體內溶素的研究提供有效數據，并在利用內溶素抑菌研究方面提供有效信息。

1　材料與方法

1.1菌株與噬菌體

宿主細菌為本實驗室購買保存的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028，噬菌體為本實驗室分離保存的烈性沙門氏菌噬菌體STP4-a，保藏號為CCTCC M 2014145，含有內溶素基因的重組大腸細菌BL21（LysSTP4）由本實驗室構建。

1.2培養基

LB肉湯、LB瓊脂、營養肉湯、營養瓊脂均購于北京陸橋技術有限責任公司。液體、固體培養基均由成品制劑與蒸餾水按規定比例配制而成。

1.3儀器與設備

HZQ-F100型振蕩培養箱哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；Sigma 3K15型高速冷凍離心機曦瑪離心機（上海）有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司；Power Wave XS型酶標儀美國Biotek公司。

1.4方法

1.4.1重組蛋白LysSTP4的制備

取工程菌BL21（LysSTP4）單菌落加入到10 mL LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養過夜，次日，按照1∶100的比例將菌液加入到新鮮的900 mL LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃培養3 h，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（至終濃度為1 mmol/L），在37 ℃條件下進行誘導表達，150 r/min振蕩培養4 h后，于4 ℃、3 381×g條件下離心15 min獲得細胞。每300 mL菌液所得的細胞沉淀懸于30 mL結合緩沖液（20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，含300 mmol/L NaCl），充分混勻后，用超聲波破碎儀進行破碎，條件為300 W、工作5 s、間隙15 s，工作次數99 次。于4 ℃、7 607×g條件下離心30 min，去除不溶性細胞碎片，上清過0.45 μm無菌濾膜，獲得粗酶液，保存在4 ℃條件下。將4 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料裝入空柱內，先后以1 mL/min的流速用純水和結合緩沖液平衡柱子，然后加入25 mL的粗酶液，用低咪唑濃度結合緩沖液（含20 mmol/L咪唑的結合緩沖液）沖洗柱子洗脫雜蛋白，6 倍柱體積的高咪唑濃度洗脫緩沖液（含100 mmol/L咪唑的結合緩沖液）洗脫目的蛋白，并按照一個柱體積每管收集流出液，收集6 管，收集其中OD280nm值較高的4 管溶液，利用3 kD超濾離心管進行脫鹽處理獲得純度較高的重組蛋白，并利用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量。將重組蛋白置于-80 ℃條件下保存，使用前置于4 ℃條件下復溶。

1.4.2LysSTP4對細菌的裂解活性測定

在前期工作中，經克隆表達純化獲得的重組蛋白LysSTP4純度高，質量濃度為400 μg/mL，利用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液稀釋至100 μg/mL進行裂解活性的測定。參考Turner等[17]的方法稍作修改，采用平板擴散法鑒定LysSTP4是否對細菌有裂解活性。取10 mL含1.5%瓊脂的培養基平鋪在平板中作為底層瓊脂，待瓊脂凝固后，在其上放置直徑為9 mm的牛津杯，另取10 mL含1.5%瓊脂的培養基，加以400 μL的經高壓滅菌致死的對數期沙門氏菌細菌，倒入平板中，待瓊脂凝固后，取出牛津杯，小孔中加入12.5 μL 100 μg/mL的LysSTP4，將平板放置于4 ℃擴散1 h后于37 ℃過夜溫育，觀察小孔周圍裂解圈。等量的pH 8.0 Tris-HCl緩沖液和100 μg/mL溶菌酶分別作為陰性和陽性對照組，以相同的條件測定對死亡沙門氏菌細胞壁的裂解效果。

1.4.3濁度法測定LysSTP4裂解穩定性

參考Mikoulinskaia等[18]的方法，挑取沙門氏菌單菌落至300 mL營養肉湯中，過夜培養，菌液中加入終質量濃度為5 g/100 mL的氯仿，室溫靜置15 min，7 607×g、4 ℃條件下離心10 min，沉淀用無菌純水洗滌、復溶、再次離心，重復兩次后獲得細菌沉淀，置于-80 ℃保存。

裂解活性通過OD450nm降低幅度間接表示[19]。在96 孔板中加入150 μL待測溶液，在37 ℃條件下測定OD450nm值。以不含內溶素的溶液作為空白對照，每組3 組平行。在37 ℃條件下10 min內OD450nm下降0.01的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.4.3.1重組蛋白LysSTP4的pH值穩定性測定

將細菌沉淀分別用20 mmol/L的三氟乙酸（pH 2.0），20 mmol/L的檸檬酸鈉（pH 3.0、pH 4.0），20 mmol/L的丙二酸鈉（pH 5.0、pH 6.0），20 mmol/L的Bris-Tris（pH 7.0），20 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol/L的甘氨酸（pH 9.0、pH 10.0）復溶，獲得不同pH值的細菌懸浮液，將100 μL重組蛋白LysSTP4溶液加入到900 μL 細菌復溶液中，利用濁度法測定不同pH值條件下的OD450nm值并按照公式（1）計算相對酶活力。

1.4.3.2重組蛋白LysSTP4溫度穩定性測定

LysSTP4蛋白溶液分裝至EP管中，分別放入30、37、45、50、55、65、75 ℃水浴鍋中恒溫處理，在0、15、30 min時，分別取100 μL與利用50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl（含0.1% Triton X-100）復溶的900 μL細菌沉淀復溶液混合均勻，測定不同溫度條件下的酶活力，并按照公式（2）計算相對酶活力。

1.4.3.3重組蛋白LysSTP4離子強度穩定性測定

將細菌沉淀用50 mmol/L pH 8.0含0.1% Triton X-100的Tris-HCl復溶后分裝至EP管中，將100 mmol/L ZnCl2、CaCl2、MgCl2和FeSO4溶液分別加入到細菌溶液中，使其終濃度分別為0、0.1、1、10 mmol/L，混勻。100 μL重組蛋白LysSTP4溶液加入到含不同離子濃度的900 μL細菌復溶液中，測定酶活力，并按照公式（3）計算相對酶活力。

1.4.3.4重組蛋白LysSTP4保存穩定性測定

將LysSTP4保存在-80 ℃條件下，測定保存0、3、6 個月的酶活力。按照公式（4）計算殘留酶活力。

1.4.4膜通透劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）對重組蛋白LysSTP4裂解效果的影響

挑取沙門氏菌單菌落至營養肉湯中，過夜培養，菌液離心后，菌體沉淀用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液復溶至細菌數量在107CFU/mL左右，將100 μL重組蛋白LysSTP4和100 μL 0.01 mol/L的EDTA溶液加入到800 μL 細菌復溶液中，37 ℃振蕩培養，0、30、60、120 min時刻，取混合液經無菌生理鹽水適當稀釋后，平板涂布法測定菌落數。同時，為測定單獨EDTA或內溶素對細菌的裂解效果，將100 μL EDTA溶液和LysSTP4分別同等體積的Tris-HCl緩沖液混合，加入到800 μL細菌復溶液中，相同培養條件下，測定菌落數目變化。

1.5數據處理

2　結果與分析

2.1重組蛋白LysSTP4對細菌的裂解活性

圖1　LysSTP4裂解活性Fig.1Lysis activity of LysSTP4

將沙門氏菌經過高壓滅菌處理后，利用LysSTP4作用于細菌，平板擴散法結果如圖1所示，同等質量濃度的重組蛋白和溶菌酶都能夠形成透明裂解圈，而陰性對照的Tris-HCl緩沖液無透明圓圈形成。表明重組的融合蛋白具有裂解活性，但與同等質量濃度的溶菌酶相比，活力要低。

2.2重組蛋白LysSTP4的pH值穩定性

圖2pH值對LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.2Effect of pH on the lytic activity of LysSTP4

pH 10條件下酶活力達到最高值，約為590 U/mL，因此將該條件下的酶活力作為基準比較其他pH值條件下的相對酶活力。由圖2可知，在pH 6～8條件下，各組之間的酶活力沒有顯著的差異（P＞0.05），約為最高酶活力的80%；而LysSTP4在pH＜5的酸性條件下，相對酶活力僅為最高酶活力的20%左右。從裂解活力上可以得知LysSTP4為一種嗜堿性裂解酶，與蠟樣芽孢桿菌噬菌體B4的內溶素重組蛋白LysB4（pH 8.0～10.0條件下有較高的酶活力）和蠟樣芽孢桿菌噬菌體BPS13內溶素

LysBPS13（pH 7.5～10.5范圍均有較高的酶活力）較為

一致[11,20]。

2.3重組蛋白LysSTP4的溫度穩定性

圖3溫度對LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.3Effect of temperature on the lytic activity of LysSTP4

重組蛋白LysSTP4在4 ℃條件復溶且未經溫水浴處理時，酶活力最高，約為360 U/mL。由圖3可知，經30、37 ℃處理30 min內酶活力沒有顯著變化；而在45、50 ℃條件下處理30 min后，酶活力顯著降低，相對酶活力約為60%；在55 ℃條件下，相對酶活力僅約為30%；隨著溫度的升高，相對酶活力顯著性下降，在65、75 ℃條件下處理30 min后，幾乎無裂解效果。這說明該內溶素高溫耐受力較弱，這也與沙門氏菌噬菌體SPN1S內溶素重組蛋白（溫度范圍25～45 ℃）較為相似[14]。

2.4重組蛋白LysSTP4的金屬離子穩定性

圖4離子強度對LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.4Effect of iron concentration on the lytic activity of LysSTP4

由圖4可知，Zn2+對LysSTP4的裂解活性有顯著的抑制效果（P＜0.05）；低濃度的Fe2+能夠提高裂解活性，但隨著濃度的升高，反而對酶活性產生了抑制效果；低濃度的Ca2+對酶沒有顯著的激活或抑制作用，但高濃度的

Ca2+對內溶素具有顯著的抑制效果（P＜0.05）；低濃度的Mg2+能夠顯著提高酶的活性，但是隨著Mg2+濃度的升高，酶活力沒有顯著的變化。

2.5重組蛋白LysSTP4的保存穩定性

圖5LysSTP4在-80℃保存條件下的殘留酶活力Fig.5Effect of preservation duration on the lytic activity of LysSTP4

將制備的重組蛋白放置于-80℃條件下保存，保存穩定性如圖5所示，在低溫冷凍保存條件下，雖然LysSTP4的酶活力有顯著降低（P＜0.05），但在6 個月后仍有高于85%的殘留酶活力，說明該內溶素在低溫條件下保存不易失活，能夠長期保存，這也利于后續的實驗研究和應用。

2.6膜通透劑EDTA與重組蛋白LysSTP4聯用裂解活細菌

由圖6可知，內溶素LysSTP4單獨作用于沙門氏菌時，在初始60 min內有顯著性的抑菌效果（P＜0.05），但繼續培育，沙門氏菌的數量呈現增長的趨勢，沒有明顯的抑菌效果（P＞0.05）；單獨使用EDTA對沙門氏菌有抑菌效果，120 min后，細菌數量由3.4×107CFU/mL降低了38.8%；EDTA和內溶素聯用對沙門氏菌有顯著性的抑菌作用，并隨時間的增加，抑菌效果更加顯著，120 min后，能將3.6×107CFU/mL的細菌有效降低約65.2%，比EDTA單獨作用時裂解效果提高了約1倍。研究結果表明，在EDTA的協同作用下，內溶素LysSTP4能夠有效地殺滅沙門氏菌。后續研究中可以通過提高LysSTP4的蛋白質含量或改變膜通透劑用量來改善內溶素的抑菌效果。

圖6LysSTP4與EDTA聯用對細菌的裂解活性影響Fig.6Lysis activity of LysSTP4for the cells treated by EDTA

由于革蘭氏陰性細菌的細胞壁外側有一層較厚的外膜，阻礙了內溶素作用于細胞壁肽聚糖層。因此，重組內溶素單獨作用革蘭氏陰性細菌時經常無效[21]。國內外研究內溶素對革蘭氏陰性細菌的作用效果時，通常采用外膜通透劑與內溶素聯用策略[22-23]。外膜通透劑按照它們的化學結構可分為兩類，一類為多肽類抗生素，如多黏菌素和其衍生物、聚賴氨酸和氨基糖苷類抗生素，該類物質具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與磷脂中帶陰電荷的磷酸根結合，使細菌外膜通透性增加。第二類膜通透劑是以最為常用的EDTA為代表的螯合劑，EDTA能夠螯合吸附二價離子，破壞外膜穩定性[24]。Briers等[25]將10 mmol/L EDTA與250 μg/mL綠膿假單胞菌噬菌體內溶素協同作用，結果表明，兩者能夠將106CFU/mL綠膿假單胞菌降低4（lg（CFU/mL））。Lim等[14]將10 mmol/L EDTA與300 μg/mL內溶素聯用在2 h內將沙門氏菌的菌落數目由106CFU/mL有效降低至103CFU/mL。

3　結3 論

目前為止，內溶素的應用主要集中在革蘭氏陽性細菌的防治和檢測中，革蘭氏陰性細菌相關的內溶素研究報道較少，尤其沙門氏菌噬菌體內溶素的研究在國內是空白狀態。通過測定LysSTP4對沙門氏菌的裂解效果，得知該沙門氏菌噬菌體內溶素LysSTP4具有生物活性，這也是國內外首例T4型沙門氏菌噬菌體內溶素克隆表達成功。LysSTP4是一種嗜堿性蛋白，在50 ℃條件下30 min仍能保持約60%的活力，并且能夠在-80 ℃長期保存，與膜通透劑EDTA協同作用能夠有效殺滅沙門氏菌。這些特性表明，LysSTP4內溶素具有成為新型抗菌物質的潛力。這些研究結果也為利用內溶素防控耐藥性沙門氏菌提供了理論基礎和技術指導。

[1] DARBY J, SHEOREY H. Searching for Salmonella[J]. Australian Family Physician, 2008, 37(10): 806-810.

[2] RANDALL L P, COOLES S W, OSBORN M K, et al. Antibiotic resistance genes, integrons and multiple antibiotic resistance in thirtyfive serotypes of Salmonella enterica isolated from humans and animals in the UK[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2004, 53(2): 208-216.

[3] VARMA J K, MOLBAK K, BARRETT T J, et al. Antimicrobialresistant nontyphoidal Salmonella is associated with excess bloodstream infections and hospitalizations[J]. Journal of Infectious Diseases, 2005, 191(4): 554-561.

[4] PAN Zhiming, WANG Xiaoquan, ZHANG Xiaoming, et al. Changes in antimicrobial resistance among Salmonella enterica subspecies enterica serovar Pullorum isolates in China from 1962 to 2007[J]. Veterinary Microbiology, 2009, 136(3/4): 387-392.

[5] 朱曉艷. 噬菌體治療新方向: 內溶素[J]. 西南國防醫藥, 2011, 21(9): 1035-1037.

[6] NELSON D, LOOMIS L, FISCHETTI V A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group a streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(7): 4107-4112.

[7] SON J S, LEE S J, JUN S Y, et al. Antibacterial and biofi lm removal activity of a podoviridae Staphylococcus aureus bacteriophage SAP-2 and a derived recombinant cell-wall-degrading enzyme[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86(5): 1439-1449.

[8] BORYSOWSKI J, WEBER-DABROWSKA B, GORSKI A. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents[J]. Experimental Biology and Medicine (Maywood), 2006, 231(4): 366-377.

[9] ZHANG Hui, BAO Hongduo, BILLINGTON C, et al. Isolation and lytic activity of the Listeria bacteriophage endolysin LysZ5 against Listeria monocytogenes in soya milk[J]. Food Microbiology, 2012, 31(1): 133-136.

[10] FISCHETTI V A. Novel method to control pathogenic bacteria on human mucous membranes[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2003, 987(1): 207-214.

[11] PARK J, YUN J, LIM J A, et al. Characterization of an endolysin, LysBPS13, from a Bacillus cereus bacteriophage[J]. FEMS Microbiology Letters, 2012, 332(1): 76-83.

[12] KIM M, KIM S, RYU S. Complete genome sequence of bacteriophage SSU5 specific for Salmonella enterica serovar Typhimurium rough strains[J]. Journal of Virology, 2012, 86(19): 10894.

[13] YUAN Yihui, PENG Qin, GAO Meiying. Characteristics of a broad lytic spectrum endolysin from phage BtCS33 of Bacillus thuringiensis[J]. BMC Microbiology, 2012, 12: 297-305.

[14] LIM J A, SHIN H, KANG D H, et al. Characterization of endolysin from a Salmonella Typhimurium-infecting bacteriophage SPN1S[J]. Research in Microbiology, 2012, 163: 233-241.

[15] 朱曉艷, 胡福泉, 譚銀玲. 摩氏摩根菌噬菌體MmP1內溶素重組蛋白活性的初步鑒定[J]. 第三軍醫大學學報, 2011, 33(23): 2463-2465.

[16] 楊曦. 大腸桿菌O157 Stx噬菌體裂解酶的原核表達及活性研究[D].上海: 上海交通大學, 2012.

[17] TURNER M S, WALDHERR F, LOESSNER M J, et al. Antimicrobial activity of lysostaphin and a Listeria monocytogenes bacteriophage endolysin produced and secreted by lactic acid bacteria[J]. Research in Microbiology, 2012, 163: 233-241.

[18] MIKOULINSKAIA G V, ODINOKOVA I V, ZIMIN A A, et al. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glutamate peptidase encoded by bacteriophage T5[J]. FEBS Journal, 2009, 276(24): 7329-7342.

[19] BRIERS Y, LAVIGNE R, VOLCKAERT G. A standardized approach for accurate quatification of murein hydrolase activity in highthroughput assays[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2007, 70(3): 531-533.

[20] SON B, YUN J, LIM J A, et al. Characterization of LysB4, an endolysin from the Bacillus cereus-infecting bacteriophage B4[J]. BMC Microbiology, 2012, 12: 33-41.

[21] WALMAGH M, BOCZKOWSKA B, GRYMONPREZ B, et al. Characterization of five novel endolysins from Gram-negative infecting bacteriophages[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2013, 97(10): 4369-4375.

［22］VAARA M，VAARA T.Polycations as outer membrane-disorganizing agents［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1983，24（1）：114-122.［23］VAARA M.Agents that increase the permeability of the outer membrane［J］.Microbiological Reviews，1992，56（3）：395-411.

［24］HELANDER I M，MATTILA-SANDHOLM T.Fluorometric assessment of gram-negative bacterial permeabilization［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，88（2）：213-219.

［25］BRIERS Y，WALMAGH M，LAVIGNE R.Use of bacteriophage endolysin EL188and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa［J］.Journal of Applied Microbiology，2011，110（3）：778-785.

Characterization of Recombinant Endolysin from a Salmonella-Infecting Bacteriophage STP4-a

LIN Hong，LI Meng，WANG Jingxue*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao266003，China）

In the present study, the recombinant endolysin from Salmonella-infecting bacteriophase STP4-a was characterized for its biochemical properties such as pH, temperature and iron concentration by the plate diffusion a n d turbidity methods. The results showed that the endolysin was stable over broad pH and temperature ranges and was active from pH 5.0 to 10 and from 30 to 50 ℃. After 6 months of storage at - 80 ℃, the activity of endolysin retained 85% of the original level. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used to increase outer membrane permeability, and it greatly enhanced the lytic activity of STP4-a endolysin.

Salmonella; lytic bacteriophage; endolysin

TS254.5

A

1002-6630（2015）05-0104-05

10.7506/spkx1002-6630-201505020

2014-05-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B05）

林洪（1962—），男，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制技術。E-mail：linhong@ouc.edu.cn

王靜雪（1976—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snow@ouc.eud.cn