赤霞珠葡萄脂氧合酶活性測定及脂肪酸組分的變化

鞠延侖，房玉林*，張莉，曾婕，劉吉彬

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌712100）

赤霞珠葡萄脂氧合酶活性測定及脂肪酸組分的變化

鞠延侖，房玉林*，張莉，曾婕，劉吉彬

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌712100）

以赤霞珠葡萄果實為研究材料，亞油酸鈉為底物，測定脂氧合酶活性；采用氣相色譜-質譜聯用技術對葡萄果皮中的脂肪酸組分進行分析。結果表明：在溫度為40℃，底物濃度為2×10-4mol/L，pH值為7.0時該酶活性最高，同時該酶在80℃高溫下仍表現出很好的熱穩定性；在赤霞珠發育過程中該酶的活性從轉色期開始上升，直到成熟前2～3周左右達到最大值，之后迅速下降，成熟期又趨于平穩。赤霞珠葡萄果皮中共檢測出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸占據了飽和脂肪酸含量的大部分，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分，脂肪酸總含量在不斷增大，成熟前1周左右含量最大。

赤霞珠；脂氧合酶；脂肪酸；酶活性；組分變化

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）首次發現于大豆中，又稱為亞油酸氧化還原酶、脂肪氧化酶、脂肪氧合酶、脂肪加氧酶或類胡蘿卜素氧化酶。研究發現脂氧合酶在各種高等植物中廣泛存在，該酶是一種蛋白質并且含有非血紅素鐵，能夠催化結構中含有順，順-1，4-戊二烯的多元不飽和脂肪酸發生加氧反應，大量存在于植物膜脂中的亞油酸和亞麻酸是該酶的主要底物，生成的過氧化氫物具有共軛雙鍵［1］，其能通過各種反應生成醛、酮、脂類等具有揮發性的小分子物質，這些物質對葡萄的風味質量有很大影響［2］。

LOX與植物的成熟、衰老密切相關，在植物受到機械傷害和病蟲侵染時能產生信號分子進行調節［3-5］；LOX與植物抗旱等抗逆性密切相關［6］；LOX酶的作用又受到脂肪酸的影響，脂肪酸組分關系到細胞膜結構和脂類，直接調節細胞膜的組分［7］，兩者的生理作用密切相關，共同對植物的生長發育起到調節作用，影響葡萄果實的質量。

隨著經濟的發展和消費水平的提高，我國對優質葡萄酒需求持續增加。由于葡萄酒質量和風格主要決定于原料，因此，通過改善葡萄原料的成熟質量，尤其是關鍵風味物質的含量，對于提高葡萄酒質量和風格具有重要的意義［8］。目前關于脂氧合酶的研究主要集中在獼猴桃、黃瓜等［9-10］植物果實中，對于葡萄果實脂氧合酶的相關研究報道很少，目前還沒有一個系統的測定方法。本研究采用分光光度計法［11-12］，通過研究溫度、底物濃度、pH值等因素對葡萄脂氧合酶活性的影響，進而確定葡萄果實脂氧合酶測定的方法，為葡萄果實脂氧合酶的測定提供理論依據。同時，通過研究赤霞珠發育過程中脂氧合酶活性及脂肪酸組分的變化，為葡萄園的管理、提高葡萄原料質量提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗材料來源于陜西楊凌曹辛莊葡萄園2008年扦插定植的赤霞珠（Cabernet Sauvignon），歐亞種（Vitis vinifera L.）釀酒葡萄品種。從果實轉色后到成熟（8月16日、8月18日、8月20日、8月22日、8月24日、8月26日、8月29日、8月30日、9月1日、9月3日、9月5日、9月7日）每3d取兩次樣。取樣方法為隨機取樣：按照五點法，除去外周兩行，每個取樣區相對固定30株生長相對中庸一致的葡萄植株，取樣保證植株陰陽兩面隨機采取。每次取樣后，樣品于0.5h內保存到—20℃的冰箱內。

石油醚、乙醚、甲醇（均為色譜級）南京化學試劑公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）、吐溫-100美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

SiruaLLL RC-5C+冷凍高速離心機（配有SS-34鋁合金角度轉頭、SLA-1000超輕鋁合金角度轉頭及250、50、12mL離心管）、Thermo Finnigan TRACE DSQ氣相色譜-質譜聯用儀（含有直接進樣裝置、頂空進樣器及熱脫附儀）美國科峻儀器公司；UV-2450紫外-可見分光光度計、AUW220D萬分之一天平、超聲波提取器日本島津公司。

1.3方法

1.3.1反應底物（亞油酸鈉母液）的制備

參考Axelrod［13］、李強［14］、陳昆松［15］等的方法，略做修改。研究所用的酶反應底物為10mmol/L亞油酸鈉母液、70mg亞油酸鈉固體、70μL Triton X-100和4mL無氧水，混勻（避免產生氣泡）后，用0.5mol/L NaOH滴定至溶液澄清，定容至25mL，分裝（1～1.5mL），-18℃保存備用。操作過程避光。

1.3.2提取緩沖液的制備

取1mL Triton X-100和4g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP），加入到100mL0.1mol/L pH6.8的磷酸緩沖液中，搖勻，置于4℃的冰箱中預冷。

1.3.3粗酶液的提取

參考陳昆松等［15］的方法，略微改動。取不同時期的葡萄樣品，分別剝取1g葡萄皮置于研缽內，在液氮下研磨，分別加入5mL經4℃預冷的提取緩沖液，4℃、12000r/min離心30min，收集上清液，得粗酶液，編號儲存，用于LOX活性測定。

1.3.4酶活性的測定

參考Axelrod［13］、李強［14］、李銘韌［16］等的方法，略做改動。反應體系中含亞油酸鈉母液25μL、磷酸緩沖液2900μL、粗酶液75μL，反應溫度25℃，于234nm波長處測定光密度值。加酶液后30s開始計時，記錄120s（每隔15s測一次）內光密度值變化。用磷酸緩沖液作為空白對照，重復3次。酶活力單位定義為每克樣品每分鐘光密度變化值增加0.01為1個LOX酶活力單位（U）。

1.3.5赤霞珠葡萄LOX酶最適反應溫度的測定

將空試管置于一定溫度（20、25、30、35、40、45、50、55、60℃）的水浴中，于試管中依次加入粗酶液75μL、磷酸鹽緩沖液（pH6.8，0.1mol/L）2900μL、亞油酸鈉母液25μL。加入底物后立刻準確計時，反應120s后立即加入4mol/L鹽酸調節pH值到3.0，此時終止反應，在234nm波長處測定光密度值。空白對照為在加入粗酶液75μL后，先加入鹽酸，再先后加入等量緩沖液和底物，反應120s。

1.3.6赤霞珠葡萄LOX酶反應最適底物濃度的測定

在室溫（25℃），pH6.8的磷酸緩沖液條件下，改變底物的濃度，測定LOX酶的活性。測定體系同1.3.4節，在3mL反應體系中加入底物（亞油酸鈉母液）的量分別為0.83×10-4、1.67×10-4、2.0×10-4、2.33×10-4、2.67×10-4、3.33×10-4、5.0×10-4mol/L，然后再通過改變所加緩沖液的體積來保證3mL反應體系保持不變。

1.3.7赤霞珠葡萄LOX酶反應最適pH值的測定

室溫條件下，改變緩沖液pH值（磷酸緩沖液pH6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0，硼酸-硼砂緩沖液pH7.4、7.6、7.8、8.0，濃度均為0.1mol/L），測定LOX酶的活性，測定體系同1.3.4節。

1.3.8赤霞珠葡萄LOX酶熱穩定性的測定

在緩沖液pH值為6.8的條件下，不同溫度（20、30、40、50、60、70、80、90℃）處理LOX粗酶液1h，然后將粗酶液放到冰上冷卻，在室溫條件下測定處理后LOX酶的活性。

1.3.9赤霞珠葡萄發育過程中LOX酶活性的變化

取2900μL0.1mol/L pH6.8磷酸緩沖液，加入25μL底物，在25℃中保溫10min，再加入不同時期的粗酶提取液75μL，混勻，30s后開始計時，在234nm波長處記錄120s（每隔15s測一次）內的光密度值，重復3次。測定LOX酶活性。

1.3.10脂肪酸的提取

［17-19］的研究方法，略微改動。取葡萄皮5g在液氮下充分研磨，加入10mL石油醚-乙醚（4∶3，V/V）混合液于0～4℃條件下提取24h。然后加入0.4mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液10mL，在室溫條件下甲酯化2h，4000r/min室溫離心10min，取上層有機相，置于10mL蒸餾燒瓶中，減壓蒸餾，定容至5mL。取1mL樣品于進樣瓶中，并加入質量濃度為100mg/mL的十七烷酸甲酯1μL作為內標物。待用。

1.3.11色譜條件

參考文獻［20-21］設置色譜條件：DB5MS石英毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；進樣1μL；分流進樣（分流比30∶l）；進樣口溫度240℃；檢測器溫度250℃；升溫程序；100℃保持1min，以8℃/min的速率升至205℃，保留0.l min，再以3℃/min的速率升至240℃，保留10min；載氣壓力（N2）0.60kg/cm2，燃氣壓力（H2）0.65kg/cm2，助燃氣壓力（空氣）0.50kg/cm2。

1.3.12質譜條件

電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度250℃；激活電壓1.5V；質量掃描范圍m/z 40～500。

2　結果與分析

2.1赤霞珠葡萄LOX酶最適反應溫度

圖1　不同溫度對赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.1Effect of temperature on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖1可知，當溫度低于40℃時，LOX酶的活性隨著溫度升高有所增加，當溫度為40℃時，LOX酶的活性達到最高，之后LOX酶活性隨溫度的升高開始迅速下降，溫度超過45℃時酶活性比20℃時的活性更低。其他果實研究發現：黃瓜果實LOX酶在40℃時有很高活性［14］，牡丹花瓣LOX酶在45℃時有很高活性［16］，與本研究結果基本一致。

2.2赤霞珠葡萄LOX酶的最適底物濃度

圖2不同底物濃度對赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.2Effect of substrate concentration on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖2可知，底物濃度小于2×10-4mol/L時，酶活性隨著底物濃度增加而不斷增大，當底物濃度為

2×10-4mol/L時LOX酶活性達到最高，之后隨著底物濃度增大，酶活性減小。這可能是由于體系中添加的亞油酸量過多，亞油酸發生自氧化，有羥基過氧化物的生成，而當體系中含有過多的羥基過氧化物時便會引起

LOX酶失活［5］。

2.3赤霞珠葡萄LOX酶的最適反應pH值

圖3不同pH值對赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.3Effect of pH on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖3可知，當pH值為7.0時，LOX酶活性最高，同時，當pH值在6.2左右時，酶活性也較高，有研究表明來源于黃瓜的LOX酶在pH7.0和pH9.0有兩個峰［14］，來源于牡丹花瓣的LOX酶在pH4.5和pH6.0有兩個峰［16］，來源于水稻的LOX酶在pH7.6和pH8.4有兩個峰［22］。植物LOX酶大都在酸性范圍內有最高活性，如獼猴桃為5.0～5.5，桃為6.0和4.5，牡丹花瓣為4.5［15-16，23］。出現兩個峰的原因可能是LOX酶含有兩種同工酶，這兩種同工酶分別有不同的最適pH值［5］。

2.4赤霞珠葡萄LOX酶的熱穩定性研究

由圖4可知，當處理溫度低于70℃時，LOX酶仍有很高活性，當處理溫度達到80℃時，酶活性雖然很小，但仍有活性，表現出很好的熱穩定性。這與李強［14］、李銘韌［16］等研究的黃瓜果實、牡丹花瓣LOX酶有很好的熱穩定性結論一致。李強等［14］對黃瓜果實LOX酶的研究表明，在20～70℃范圍內其活性隨處理溫度升高而緩慢升高，李銘韌等［16］對牡丹花瓣LOX酶的研究表明其活性在30～50℃和60～80℃內會隨處理溫度升高而升高，但是本研究中葡萄LOX酶活性此現象不是很明顯。

圖4赤霞珠葡萄LOX酶熱穩定性Fig.4Thermal stability of lipoxigenase in Cabernet Sauvignon grapes

2.5赤霞珠葡萄發育過程中LOX酶活性的變化

圖5赤霞珠葡萄發育過程中LOX活性的變化Fig.5Change in LOX activity during the development process of Cabernet Sauvignon grapes

由圖5可知，赤霞珠葡萄在發育過程中LOX酶活性開始略有增加之后呈下降趨勢，到成熟期基本趨于平穩。由于實驗取樣時間較晚，使得LOX酶活性增加趨勢不夠明顯。由于LOX酶有很多對植株有利的生理功能［1，4，24］，研究葡萄果實發育過程中LOX酶活性的變化，對于研究葡萄植株的生長、發育、衰老、抗逆性等有很大幫助，可為葡萄園的管理提供理論支持，提供高質量的葡萄原料，有利于提高葡萄酒質量。

2.6脂肪酸組分的變化

由表1可知，赤霞珠葡萄皮中共檢測出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸含量在飽和脂肪酸含量中所占比例較大，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分。由表2可知，隨著果實的不斷成熟，果實中的脂肪酸總量開始不斷增加，到完全成熟前1周達到最大值，之后又下降。

表1　赤霞珠葡萄果皮中脂肪酸（甲酯）的組成Table1Fatty acid composition of grape skins kins

表2葡萄果實不同采收時期脂肪酸含量的變化Table2Change in fatty acids during different development periods of grapes pes mg/kg

3　結論與討論

研究了不同反應溫度、底物濃度、pH值對赤霞珠果實中脂氧合酶活性的影響，確立葡萄漿果中脂氧合酶活性的測定方法；研究了赤霞珠葡萄發育過程中脂氧合酶及脂肪酸組分的變化。本研究結果證明，當反應溫度為40℃時，葡萄LOX酶有很高活性；該酶表現出較好的熱穩定性。在其他植物LOX酶反應溫度的研究中發現LOX酶也有很好的熱穩定性［14，16］。

隨著底物添加量增大，底物濃度增大，LOX酶的活性也不斷增大，到底物濃度為2×10-4mol/L時活性達到最大，底物濃度大于2×10-4mol/L時，酶活性不再增大，反而降低，這是由底物自身氧化產生的羥基過氧化物導致LOX酶失活引起的［5］。

當pH值為7.0時，LOX酶活性最高，同時，當pH值在6.2左右時，酶活性也有一個相對最高值，表明葡萄LOX酶可能含有兩種同工酶［5］。在其他植物LOX酶最適pH值的研究中也有兩個峰值的現象，本研究結果與此吻合［5，14-15］。

在發育過程中赤霞珠葡萄LOX酶活性先增大后減小，成熟期趨于穩定，這可能與脂氧合酶的生理作用有關，在發育過程中LOX酶活性與外界的環境緊密相關［5］。脂肪酸總量先增加到成熟前1周達到最大含量，之后又有所下降；赤霞珠葡萄皮中檢測出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸占據了飽和脂肪酸含量的大部分，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分，這與梁茂雨［19］、李浡［25］等的研究結果基本一致。果實中脂氧合酶活性及脂肪酸的含量變化與其生理功能密切相關，研究為提高原料質量提供理論依據。

LOX酶是葡萄果實脂肪酸代謝途徑中的關鍵酶，使脂肪酸代謝產生具有共軛雙鍵的過氧化氫物，最終生成茉莉酸進而增強植株的抗性［5］，同時脂肪酸作為細胞膜的組成部分又潛在影響著LOX酶的活性。本研究測定了赤霞珠發育過程中LOX酶活性及脂肪酸組分的變化，分析了赤霞珠發育過程中LOX酶的變化規律，脂肪酸組分的變化及其主要成分，結合LOX酶和脂肪酸在植株生長發育過程中的生理學功能及相互作用，從而為葡萄園的管理提供理論支持，提供高質量的釀酒原料，對現實生產有重要意義。

參考文獻：

［1］曹慧，永章，杜俊杰，等.脂氧合酶研究進展［J］.安徽農業大學學報，2001，28（2）：219-222.

［2］汪仁，沈文飚，翟虎渠，等.植物種子脂氧合酶［J］.植物生理學通訊，2005，41（3）：388-394.

［3］生吉萍，申琳，羅云波.果實成熟衰老相關酶的研究進展［J］.食品與機械，2000，16（3）：7-9.

［4］陳昆松，張上隆.脂氧合酶與果實成熟衰老［J］.園藝學報，1998，24（4）：338-344.

［5］BAYSAL T，DEMIRDOVEN A.Lipoxygenase in fruits and vegetables［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40（5）：491-496.

［6］XIANG Zhenkong，LI Xianghong，WANG Hongjing，et al.Effect of lipoxygenase activity in defatted soybean flour on the gelling properties of soybean protein isolate［J］.Food Chemistry，2008，106（10）：1093-1099.

［7］張越華，曾和平.脂肪酸在生命過程中的作用研究進展［J］.中國油脂，2006，31（12）：11-15.

［8］李華，王華，袁春龍，等.葡萄酒工藝學［M］.北京：科學出版社，2007：57-67.

［9］李彩鳳，趙麗影，陳業婷，等.高等植物脂氧合酶研究進展［J］.東北農業大學學報，2010，41（10）：143-149.

［10］章銀良，閆克玉，馬慶一.脂氧合酶活性研究及其對食品質量的影響［J］.食品工業科技，2002，23（7）：22-24.

［11］李會容，趙昶靈，楊煥文，等.高等植物脂氧合酶活性測定的研究進展［J］.中國農學通報，2011，27（15）：217-223.

［12］鐘芳，王璋，許時嬰.3種脂肪氧合酶酶活測定方法［J］.無錫輕工大學學報，2001，20（1）：77-80.

［13］AXELROD B，CHEESBROUGH T M，LEAKSO S.Lipoxygenase from soy-beans［J］.Methods in Enzymology，1981，10（7）：443-451.

［14］李強，吳曉露，李紅偉，等.黃瓜果實脂氧合酶活性測定方法的建立［J］.東北農業大學學報，2008，39（5）：62-65.

［15］陳昆松，徐昌杰，許文平，等.彌胡桃和桃果實脂氧合酶活性測定方法的建立［J］.果樹學報，2003，20（6）：436-438.

［16］李銘韌，史國安.牡丹花瓣脂氧合酶測定方法的研究［J］.山東農業科學，2010，9（4）：91-93.

［17］邊梅娜，劉紅進，曾紅，等.赤霞珠葡萄籽油的提取及脂肪酸組分分析［J］.食品科學，2013，34（4）：297-300.

［18］徐聃，朱傳娟，蘇海霞.氣相色譜法測定葡萄子的脂肪酸含量［J］.農產品加工，2005，9（8）：74-76.

［19］梁茂雨，劉鋼湖.紅提葡萄中有機酸成分的GC-MS分析［J］.食品研究與開發，2007，28（10）：148-149.

［20］張莉，魏冬梅，王華.葡萄籽油脂肪酸GC-MS色譜分析條件優化［J］.食品研究與開發，2013，34（3）：63-65.

［21］牛翠嬌，史玉琴，殷志萍，等.氣相色譜-質譜法測定食品中的反式脂肪酸［J］.安徽農業科學，2011，39（6）：3649-3651.

［22］姚鋒先，曾曉春，蔣海燕，等.水稻中以亞麻酸為底物的脂氧合酶活性測定［J］.江西農業大學學報，2006，28（2）：183-186.

［23］LYNCH D V，SRIDHARA S，THOMPSON J E.Lipoxygenase-generated hydroperoxides account for the nonphysiological features of ethy-lene formation from1-aminocyclop ropane-1-carboxylic acid by microsomal membranes of carnations［J］.Planta，1995，164（5）：121-125.

［24］黃珊珊，李長鎖，楊明亮，等.水楊酸、茉莉酸途徑4種關鍵酶與大豆抗蚜性的研究［J］.作物雜志，2012，18（5）：54-58.

［25］李浡，李雙石，章宇寧，等.釀酒葡萄皮油成分的氣相色譜-質譜分析［J］.食品科技，2012，37（12）：270-274.

Determination of Lipoxygenase Activity and Change in Fatty Acid Composition in Cabernet Sauvignon Grape Berries

JU Yanlun，FANG Yulin*，ZHANG Li，ZENG Jie，LIU Jibin
（Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture，College of Enology，Northwest A&F University，Yangling712100，China）

In this work，a spectrophotometric assay was used to investigate the lipoxygenase activity in Cabernet Sauvignon grapes using linoleic acid sodium as a substrate as a function of reaction temperature，substrate concentration and pH.Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）was used to analyze the fatty acid composition in grape skin.The changes in lipoxygenase activity and fatty acid composition in Cabernet Sauvignon during grape berry development were examined.The enzyme had the highest activity under the reaction conditions：40℃，a substrate concentration of2×10-4mol/L，and pH7.0.The enzyme activity also showed good thermal stability at80℃.At the veraison stage，the enzyme activity began to increase，and reached the maximum level at2-3weeks before maturity followed by a sharp decrease and then stabilization during the ripening stage.Thirteen kinds of fatty acids were detected in Cabernet Sauvignon grape skins.Palmitic acid and stearic acid dominated the identified saturated fatty acids；the predominant unsaturated fatty acids were oleic acid，linoleic acid and linolenic acid.The total fatty acid content reached the maximum at about1week before maturity.

Cabernet Sauvignon；lipoxygenase（LOX）；fatty acid；enzyme activity；composition change

TS255.2

A

1002-6630（2015）05-0115-05

10.7506/spkx1002-6630-201505022

2014-05-02

農業部“948”項目（2014K30902140）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）；國家現代農業（葡萄）產業技術體系建設專項（nycytx-30-2p-04）

鞠延侖（1990—），男，碩士研究生，主要從事葡萄生理生化研究。E-mail：1169679203@qq.com

房玉林（1973—），男，教授，博士，主要從事葡萄生理生化與葡萄資源綜合利用研究。E-mail：fangyulin@nwsuaf.edu.cn