沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其生物學特性

包紅朵，張鵬禹，，周　艷，張莉莉，張　輝，陶明煊，王　冉，*

（1.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，農業部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇南京210014；2.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097）

沙門氏菌裂解性噬菌體的分離鑒定及其生物學特性

包紅朵1，張鵬禹1，2，周艷1，張莉莉1，張輝1，陶明煊2，王冉1，*

（1.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，農業部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇南京210014；2.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097）

從家禽屠宰場污水中，以腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184為宿主菌，分離到兩株裂解性沙門氏菌噬菌體，分別命名為vB_SenM-PA13076（簡稱PA13076）和vB_SenM-PC2184（簡稱PC2184）。同時對這兩株噬菌體進行了噬菌斑、噬菌譜系（含耐藥菌）、形態學（透射電鏡）、遺傳物質、酸堿及熱穩定性、最佳感染復數、一步生長曲線等生物學特性研究。結果表明：兩株噬菌體的裂解空斑均透亮清晰；除對本身宿主菌產生強裂解作用，還裂解其他沙門氏菌，為寬噬菌譜，其中PA13076能強裂解一株耐氨芐青霉素ATCC13076轉化菌株（A+13076），PC2184則能裂解另一株耐氨芐青霉素CVCC2184轉化菌株（A+2184）；電鏡觀察這兩株噬菌體均為肌尾病毒科；遺傳物質為dsDNA；pH值和溫度耐受能力較好；PA13076、PC2184最佳感染復數分別為0.01、10，潛伏期分別為20、30min，爆發期分別為70、60min，平均爆發量分別為21、23。

腸炎沙門氏菌；裂解性噬菌體；生物學特性；耐藥性

沙門氏菌（Salmonella）居食源性疾病致病菌之首位，是全球最常見食源性病原菌，常引起食品安全事故［1］。DuPont等［2］報道沙門氏菌引起的食源性疾病在持續增加，表明當前食源性致病菌的滅菌技術并非絕對可靠。中國疾病控制中心報告的食物中毒數據顯示沙門氏菌引起的發病人數比例居首，達13.8%［3］。2013年10月9日，美國18個州爆發了沙門氏菌引起的食物中毒事件，近300人生病［4］；4d后美國南舊金山4萬磅禽類產品又因沙門氏菌污染召回［5］?？梢姡抽T氏菌污染可帶來嚴重的食品安全隱患，更嚴峻的是，沙門氏菌的耐藥性正日益增強［6］，在中國［7-8］和其他國家［9］都正在引起廣泛關注。

噬菌體作為細菌的天敵，已被科學家作為對付多重耐藥菌新的希望，因此也成為了當前的研究熱點。2006年，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準李斯特菌噬菌體制劑在即食食品（ready-to-eat）和禽類產品中使用，隨后，沙門氏菌噬菌體產品如Intralytix公司的SalmonFresh也相繼通過美國FDA評價食品添加劑的安全性指標認證（Generally Recognized as Safe，GRAS），獲得FDA應用批準，這為噬菌體的商業化應用奠定了基礎。本研究分離獲得兩株裂解性腸炎沙門氏菌噬菌體，并分析了其生物學特性和裂解特性，為噬菌體產品控制沙門氏菌污染或感染的進一步研究提供了基礎數據參考。

1　材料與方法

1.1菌種、培養基與試劑

菌種：分離噬菌體的宿主菌為腸炎沙門氏菌ATCC13076、禽沙門氏菌CVCC2184；腸炎沙門氏菌分離株K14、K16、K17、K23、K27、SR1、SR2、SR3、SR4、SR5；鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，分離株J521、K12；甲型副傷寒沙門氏菌ATCC50073，乙型副傷寒沙門氏菌分離株HNER067-1、HNER067-2、J300、J342；雞白痢沙門氏菌CMCC533，分離株S96115、C905、S96116、S9627、S8645、S9685、S96109、S9695、S9103、S0701、S9649、S11-2、S11-3、S11-4-1、S11-4-2；鴨沙門氏菌分離株D9；2株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+13076、A+2184（由本實驗室通過導入質粒pUC18分別標記ATCC13076和CVCC2184制得）。污水樣：采自南京及周邊家禽屠宰場。

TSB-YE、LB培養基、瓊脂青島高科園海博生物科技有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000、DNaseⅠ、RNaseA酶北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；限制性內切酶日本TaKaRa公司；氯仿、鹽酸、NaCl、MgSO4·7H2O均為分析純。

1.2儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；SW-CJ-1F超凈臺蘇州真田潔凈設備有限公司；HZL-F160全溫振蕩培養箱太倉市強樂實驗設備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱上海一恒科技有限公司；DELTA320pH計瑞士Mettler Toledo公司；HFU486Basic超低溫冰箱德國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1噬菌體的分離富集

參照Mclaughlin等［10］的方法分別以腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184為宿主菌分離噬菌體，首先在南京及周邊家禽屠宰場采集污水樣品，水樣中加無菌生理鹽水對濃稠水樣稀釋，濾紙過濾，4℃條件下8000×g離心濾液20min，得上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。取濾液5mL，分別加入ATCC13076、CVCC2184等沙門氏菌液1mL和15mL LB培養液，室溫靜置30min，37℃、150r/min振蕩過夜進行噬菌體富集培養。4℃、8000×g離心過夜培養物20min，取上清重復富集操作3次，用0.22μm濾膜過濾得含噬菌體的原液，4℃條件下保存備用。

1.3.2噬菌斑的純化及噬菌體顆粒制備

進行單層平板點樣實驗［11］，用涂布棒將100μL過夜培養的宿主菌于LB平板上涂開，滴加噬菌體原液10μL，陰性對照組（CK）滴加等量LB培養液，37℃培養12h，觀察菌苔形成情況。挑選菌苔上出現明顯溶菌空斑的樣品，進行雙層平板實驗［12］。噬菌體原液用SM緩沖液進行10倍稀釋，取100μL合適濃度梯度的稀釋液與100μL對應宿主菌混勻靜置15min，加入3.5mL55℃左右的0.6%瓊脂LB培養基，迅速混勻倒入1.2%瓊脂LB平板上，凝固后37℃培養12h。標記雙層平板上形態一致的典型噬菌斑，用槍頭移取噬菌斑于5mL LB培養液中，加入200μL對應宿主菌，室溫放置15min，37℃條件下培養12h，4℃、11000×g離心10min，得上清液。單一噬菌斑重復該純化操作3～5次即得純化噬菌體。

噬菌體純化顆粒通過《分子克隆實驗指南》中關于λ噬菌體顆粒的PEG/NaCl沉淀提取方法進行制備［13］，噬菌體顆粒溶于SM緩沖液中，4℃條件下保存備用。

1.3.3噬菌體宿主譜的點樣實驗

采用點樣實驗分析噬菌體的噬菌譜［14］。統計各細菌的裂解情況即得該噬菌體的宿主譜。

1.3.4噬菌體透射電鏡觀察

將10μL噬菌體（108～1010PFU/mL）滴加在銅網上，靜置沉淀15min，吸去多余液體。滴加體積分數2%、pH7.0的磷鎢酸（phosphotungstic acid，PTA）染色5～10min［12］，自然干燥后用日立H7650型透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態。

1.3.5噬菌體遺傳物質酶切分析

參照《分子克隆實驗指南》提取噬菌體基因組［13］，并于-20℃條件下保存備用。限制性核酸內切酶有HindⅢ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、SalⅠ、BamHⅠ、SacⅠ、NcoⅠ，根據酶供應商的說明書進行基因組酶切操作，酶作用結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察。

1.3.6噬菌體酸堿穩定性和熱穩定性的測定

調pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13的蛋白胨水。取不同pH值蛋白胨水與噬菌體等量混合，37℃水浴2h測定效價；取100μL噬菌體于離心管中，測定初始效價，將離心管分別于30、40、50、60、70、80℃的水浴環境中作用30、60min，測定噬菌體效價變化。兩個實驗均重復3次，每次設2個平行。

1.3.7噬菌體最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）的測定

取對數期宿主菌，按不同感染復數1∶1000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1加入噬菌體和宿主菌，37℃、150r/min振蕩培養5h，10000×g、4℃離心10min，得上清液測定各組噬菌體效價。實驗重復3次，設置不加噬菌體的宿主菌培養液為實驗對照。

1.3.8噬菌體一步生長曲線實驗分析

參考Leuschner等［15］的方法，取對數期細菌，以MOI≥10加入噬菌體，37℃水浴15min，10000×g離心1min，去上清，LB液洗滌兩次，細菌沉淀加入37℃條件預熱的LB液中混勻，迅速于37℃、180r/min振蕩培養，同時開始計時。每10min取樣測噬菌體效價，設立不加噬菌體的宿主培養液和不加宿主菌的噬菌體作為實驗對照。以感染時間為橫坐標，噬菌體效價對數值為縱坐標，繪制一步生長曲線，實驗重復3次，每次設2個平行。

2　結果與分析

2.1噬菌體的分離純化及其噬菌斑形態、透射電鏡觀察

圖1　腸炎沙門氏菌噬菌體原液單層平板點樣實驗Fig.1Spot tests of Salmonella enteritidis bacteriophages in the liquid samples

由圖1可知，在單層平板上點樣得到腸炎沙門氏菌ATCC13076和禽沙門氏菌CVCC2184的噬菌空斑，而陰性對照組（CK）正常長出菌苔。在雙層平板上兩株噬菌體均呈現出典型裂解性噬菌體特征，空斑透亮，邊緣整齊清晰，無暈環。37℃培養12h，在LB培養平板上PA13076噬菌斑直徑為0.5～1.0mm，PC2184為1.0～1.5mm（圖2）。

圖2腸炎沙門氏菌噬菌體PA13076（A）和禽沙門氏菌噬菌體PC21842184（B）的噬菌斑Fig.2Plaques of Salmonella enteritidis phage PA13076（A）and Salmonella phage PC2184（B）

圖3噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）的透射電鏡觀察Fig.3Ttransmission electron micrographs of phage PA13076（A）and PC2184（B）

由圖3可知，噬菌體PA13076頭部偏橢圓形，長徑約87nm，橫徑約66nm，具有可收縮性尾，尾長約90nm，直徑約18nm，頭部與尾部被頸圈隔開，PC2184頭部呈正多面體形狀，長徑約68nm，橫徑約65nm，具有可收縮肌鞘，尾長約106nm，直徑約17nm，按國際病毒分類委員會分類規則［15］，將它們歸為有尾噬菌體目，肌尾病毒科。

2.2噬菌體的宿主譜分析

噬菌體PA13076能裂解ATCC13076、A+13076等17株不同種的沙門氏菌；而PC2184能裂解CVCC2184、A+2184等33株沙門氏菌；這些宿主菌中涵括耐藥性腸炎、腸炎、鼠傷寒、雞白痢、乙型副傷寒和鴨沙門氏菌；同時它們也具有一定范圍的交叉宿主菌譜（表1）。

表1　噬菌體PC2184和PA130766的宿主譜Table1Host range of phage PC2184and PA1133007766

續表1

2.3噬菌體遺傳物質的酶切鑒定分析

圖4噬菌體PA13076和PC2184基因組DNAA酶切圖譜Fig.4Agarose gel electrophoresis of the genomes of phage PA13076and PC2184digested with restriction enzymes

將提取得到的噬菌體基因組進一步進行酶切電泳實驗，由圖4可知，合適的限制性核酸內切酶處理噬菌體基因組后，DNA被消化片段化，表明它們的遺傳物質為dsDNA（雙鏈DNA）。

噬菌體PA13076基因組能被限制性內切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ切開，PC2184則能被EcoRⅠ、EcoRⅤ和HindⅢ切開，其他限制性內切酶不能消化它們的基因組（圖4）。酶切片段經計算得到噬菌體PA13076的基因組大小約為57k b，而PC2184為59kb，更準確的基因組大小要在測序后才能確定，根據酶切片段只能進行大概估算。

2.4噬菌體的酸堿穩定性和熱穩定性

圖5噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）對酸堿的耐受能力Fig.5Resistance of PA13076（A）and PC2184（B）to acid and alkali

由圖5可知，噬菌體PA13076在pH6～11范圍內效價較穩定，pH值小于6以及大于11都會引起效價的明顯減少，但在pH值為12的強堿環境中噬菌體仍具有較高效價，pH≤3或≥13時，才基本檢測不到噬菌斑。PC2184在pH6～9范圍內效價較穩定，pH值降到5或升到10時，效價下降較明顯，當pH≤4或≥12，大部分噬菌體已經失活。

圖6噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）對溫度的耐受能力Fig.6Resistance of PA13076（A）and PC2184（B）to temperature

由圖6可知，噬菌體PA13076在各溫度下作用30、60min后效價變化無太大差別，30、40、50℃下幾乎維持在初始效價，但60℃時下降較快，70℃之后已基本無噬菌體存在；PC2184在30、40、50、60℃條件下效價下降很少，70℃時，效價降低較快，且60min組降低幅度大于30min組，80℃時，60min組已檢測不到噬菌體，30min組效價則下降到2.15×102PFU/mL，表明高溫會嚴重破壞噬菌體的活性。

2.5噬菌體最佳感染復數

表2噬菌體PA13076的最佳MOII測定結果

Table2Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of phage PA1133007766

MOI細菌數/CFU噬菌斑/PFU效價/（PFU/mL）100∶13×1063×1085.2×10810∶13×1063×1073.3×1081∶13×1063×1061.4×1081∶103×1063×1052.1×1081∶1003×1063×1041.5×1091∶10003×1063×1032.5×108

由表2可知，噬菌體PA13076的MOI為1∶100時，宿主菌釋放的子代噬菌體效價為1.5×109PFU/mL，在各實驗組中最高，為最佳MOI。由表3可知，當MOI為10∶1時，PC2184的效價為7.0×109PFU/mL，是產生子代噬菌體顆粒最多的一組，為噬菌體擴增時的最佳MOI值。

表3噬菌體PC2184的最佳MOI測定結果ITable3Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of Table3Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）of phage PC2184C2184

2.6噬菌體的一步生長曲線

圖7噬菌體PA13076（A）和PC2184（B）在37℃的LB培養液中的一步生長曲線Fig.7One-step growth curves of phage PA13076（A）and PC2184（B）in LB at37℃

由圖7可知，噬菌體PA13076感染宿主菌的潛伏期約20min，爆發持續時間約70min，算得平均爆發量為21（平均爆發量=爆發末期的噬菌體效價/感染初期的宿主菌濃度）；PC2184潛伏期約30min，爆發持續時間約60min，平均爆發量為23，具有較高的裂解活性。

3　討論

3.1抗耐藥性沙門氏菌噬菌體的分離鑒定

單層平板點樣得到菌苔上的溶菌區域較大，可見富集后的噬菌體效價較高。通過點樣驗證實驗有些實驗菌中出現較混濁的溶菌區域或外圈透亮但中間混濁的環狀溶菌區域，表明該實驗菌對該噬菌體不完全敏感。雙層平板實驗在噬菌體研究中既是噬菌體數量（效價）計算的基本方法，也是噬菌體篩選純化的經典手段［16］。根據包紅朵［12］和王冉［17］等的報道，雙層平板上裂解性噬菌體的噬菌斑規則透亮、邊緣清晰，與本研究中噬菌斑的特點吻合。綜合形態學等信息，將這兩株噬菌體命名為vB_SenM-PC2184和vB_SenM-PA13076，其中vB：viruses bacteriophage（病毒噬菌體）；Sen：Salmonella enteritidis（腸炎沙門氏菌）；M：Myoviridae（肌尾病毒科）。該命名比一般文獻中報道的更科學，能表達出噬菌體必要的一些分類信息。Bueno等［18］對兩株噬菌體進行類似命名為vB_SauS-phi-IPLA35和vB_SauS-phi-IPLA88，其中Sau：Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）；S：Siphoviridae（長尾病毒科）。噬菌體按核酸類型及單雙鏈形式分為4個“群”，“群”是噬菌體分類的第一個級階［15］，dsDNA病毒群在文獻中最為常見，種類最多，本研究兩株噬菌體也不例外。

本研究兩株噬菌體均能裂解多株分離菌，屬寬譜噬菌體，噬菌體PC2184宿主譜較噬菌體PA13076廣，能裂解實驗室39株沙門氏菌中的33株（84.6%），宿主譜可為兩株噬菌體的復配殺菌應用提供參考。Carey-Smith等［19］曾報道噬菌體FGCSSa1，其宿主譜涵括6株不同種沙門氏菌；Capparelli等［20］分離到腸炎沙門氏菌噬菌體Ф1，則能裂解18株沙門氏菌中的16株。值得注意的是，PA13076能強裂解一株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+13076；而PC2184對另一株耐氨芐青霉素腸炎沙門氏菌A+2184的溶菌空斑不夠清晰，裂解作用稍弱。這兩株噬菌體所呈現出的對耐藥性腸炎沙門氏菌的裂解性，為耐藥性腸炎沙門氏菌的殺滅及其生物防控提供了新的解決思路，并為相關新型抗菌劑的研究提供了有力佐證。

3.2兩株噬菌體的生物學特性研究

PC2184的酸堿耐受能力不及PA13076，但明顯優于JS01等噬菌體［21］，PA13076耐酸堿能力很強，尤其對堿的耐受能力明顯優于PK88-4、LipG2-5等噬菌體［17，22］，與qds001類似，在一定程度上畏酸嗜堿［23］。PC2184熱穩定性較高，與PK88-4等噬菌體相近［17］；PA13076熱穩定性不及PC2184，與LipG2-5相仿［21］，但明顯優于qds001等噬菌體［23］。本研究中噬菌體耐酸堿能力和耐熱性的數據可為其實際應用條件提供參考。

根據Lu等［11］描述，感染發生前噬菌體與宿主菌數量的比值即為感染復數，獲得子代噬菌體產量最高的即為最佳感染復數。感染復數是研究噬菌體投入與產出量效關系的重要指標［20］，最佳MOI因噬菌體種類不同而存在差異，在噬菌體產品的生產制備中將具有重要的指導意義。噬菌體生長可分為3個時期：噬菌體在宿主菌上的吸附；噬菌體在宿主菌里面的生長（潛伏期）；噬菌體的釋放（爆發期）［24］。潛伏期是指從噬菌體吸附宿主菌到第一次爆發開始之間的時間區段，爆發量即為最終釋放出來的噬菌體顆粒數與潛伏期初始感染的宿主菌細胞數的比值［11］。于龍等［25］報道的噬菌體SM701的潛伏期約30min，與PC2184相近，爆發期約100min，爆發量約63，均大于本研究的兩株噬菌體。Leuschner等［15］報道的噬菌體PWH2與本研究相比顯示出更長的潛伏期，達到90min，爆發期60min，爆發量較高，為110。本研究得到兩株全新的腸炎沙門氏菌噬菌體PA13076和PC2184，與其他噬菌體相比具有一些共性的生物學特性，但又表現出不一樣的特點，特別是它們對耐藥宿主菌的裂解作用，為后續針對耐藥性腸炎沙門氏菌的防控研究提供了重要的參考意義。

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Isolation and Biological Characteristics of Lytic Salmonella Bacteriophage

BAO Hongduo1，ZHANG Pengyu1，2，ZHOU Yan1，ZHANG Lili1，ZHANG Hui1，TAO Mingxuan2，WANG Ran1，*
（1.Jiangsu Key Laboratory of Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base of MOST，Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Institute of Food Safety and Inspection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing210014，China；2.Ginling College，Nanjing Normal University，Na njing210097，Chi na）

Two lytic Salmonella bacteriophages，namely vB_SenM-PA13076（PA13076）and vB_SenM-PC2184（PC2184）that can inactivate ATCC13076or CVCC2184were isolated from the sewage samples of poultry slaughtering plants.Their biological properties were identified by plaque，host range（antibiotic-resistant bacteria），transmission electron microscopy（TEM），genetic material，pH and thermostability，optimal multiplicity of infection（MOI）and one-step growth experiment.Thei r plaq ues on host strains were clear and bright，and also caused bacteriolysis to other strains of Salmonella.PA13076could strongly cause bacteriolysis to an ampicillin-resistant strain SE A+13076，while PC2184only lyse another strain A+2184slightly.The newly isolated bacte riophages were the members of family Myoviridae according to their ultrastructure under TEM.Their genomes were dsDNA and revealed excellent tolerance to pH and temperature.The MOI of PA13076（PC2184）was0.01（10），and the latent period was20min（30min），the burst period was70min（60min）and the average burst size was21（23）phages per cell.

Salmonella enteritidis；lytic phage；biological characteristic；multi-antibiotic resistance

Q939.48

A

1002-6630（2015）05-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201505025

2014-04-30

江蘇省自然科學基金項目（BK2012788）；江蘇省農業科技自主創新資金探索性項目（CX（12）5040）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31402234）

包紅朵（1984—），女，助理研究員，博士研究生，主要從事噬菌體防治細菌性疾病研究。E-mail：baohongduo@jaas.ac.cn

王冉（1973—），女，研究員，博士，主要從事畜產品安全和健康養殖研究。E-mail：wangran2001@126.com