鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯在青春期小鼠體內的代謝動力學研究

張丹，葉逵，王家家，徐海，宋星星，金忠秀，盛杰，李李，劉開永*

（安徽醫科大學公共衛生學院，安徽合肥230601）

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯在青春期小鼠體內的代謝動力學研究

張丹，葉逵，王家家，徐海，宋星星，金忠秀，盛杰，李李，劉開永*

（安徽醫科大學公共衛生學院，安徽合肥230601）

研究鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）在青春期小鼠體內的代謝動力學，以300mg/kg DEHP灌胃青春期小鼠，血清樣品經固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）提取和凈化，氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定不同時間點的血藥質量濃度，以3p97軟件擬合其動力學參數。DEHP在青春期小鼠體內的主要藥物代謝動力學參數：藥峰質量濃度ρmax為（0.47 6±0.028）μg/mL，達峰時間Tpeak為（2.539±0.424）h，藥-時曲線下面積AUC（0-t）為（32.209±11.220）h?μg/mL，分布半衰期t1/2α為（1.886±0.480）h，消除半衰期t1/2β為（36.473±8.324）h。本方法簡便快捷，其靈敏度和準確度均可滿足青春期小鼠體內DEHP代謝動力學研究。DEHP在青春期小鼠體內藥物代謝動力學過程符合一級吸收二室開放模型，其分布較快，代謝較慢。

藥物代謝動力學；氣相色譜-質譜聯用；固相萃取；鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是增塑劑的一種，以非共價鍵形式與塑料產品的聚烯烴類分子結合，因而容易脫落進入環境中，廣泛存在于食品和化妝品包裝、兒童玩具等[1-5]。鄰苯二甲酸酯對生殖系統的毒性作用被認為具有年齡依賴性，可能是由于胎兒期和青春期機體器官發育，較成人更為敏感[6-10]。DEHP作為一種環境激素類物質，可擾亂機體內分泌功能[11-13]。已有多項研究證實其具有肝臟和腎臟毒性[14-16]，從而影響DEHP在機體內的吸收、分布、代謝和排泄及血液藥物濃度的動態變化規律。青春期的發動和進程受到神經內分泌系統的調控，人類的青春期性征發育或性功能發育年齡正在提前，由此也產生了一系列負面作用[17-18]。同樣DEHP在青春期人群體內的代謝動力學也將改變，但遺憾的是鮮有該方面的研究報道。本實驗以青春期小鼠為研究對象，氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定血清樣品中的DEHP含量，研究其在青春期小鼠體內藥物代謝動力學特征，為進一步評估DEHP在動物體內的代謝與檢測其在食品中的殘留提供參考依據。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

6 周齡清潔級ICR小鼠，雄鼠30 只、雌鼠30 只，購自安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（皖）2011-002。實驗前適應性喂養一周，自由飲食，溫度23～25 ℃，晝夜均衡；飼料和墊料購自江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司，飼料合格證號和墊料檢測報告編號分別為蘇飼審（2008）01008和104242016608D。

HLB固相萃取柱（1 mL，30 mg） 美國Waters公司；DEHP標準品（純度≥99.5%） 美國Sigma公司；色譜級甲醇 美國Tedia公司；DEHP原料藥（純度＞99.0%）、甲基叔丁基醚（純度≥99%） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；ASE-12固相萃取裝置、AP-02B型無油真空泵天津奧特賽恩斯儀器有限公司；N-EVAP-112氮吹儀美國Organomation公司。

1.3方法

1.3.1動物分組、處理及取樣

隨機挑選48 只健康ICR小鼠（雌雄各半）分為8 組，灌胃前禁食（不禁水）8 h，DEHP（溶于玉米油）按300 mg/kg（以體質量計，下同）灌胃給藥，分別于給藥后0.25、0.67、1.5、3、6、12、24、48 h對小鼠進行眼球摘除法采血，離心取血清。剩余小鼠灌胃等量玉米油，于灌胃后1 h同樣采血分離血清。

1.3.2樣品處理

吸取0.2 mL血清，加入0.6 mL生理鹽水混勻，渦旋10 s，混勻備用。固相萃取柱活化：加入1 mL甲醇，流速2 mL/min；萃取柱平衡：加入1 mL生理鹽水，流速2 mL/min；上樣：將0.8 mL血清生理鹽水混合樣品加入固相萃取柱，流速1 mL/min；萃取柱洗脫：依次加入生理鹽水、10%、30%、50%甲醇溶液，流速1 mL/min；萃取柱洗脫：加入1 mL 10%甲醇-甲基叔丁基醚，流速1 mL/min，收集洗脫液，氮氣吹干后加入0.6 mL甲醇復溶，上機檢測。樣品處理過程所使用的玻璃器具均用鉻酸洗液浸泡24 h，超純水沖洗后，色譜級甲醇潤洗3 次，105 ℃烘干2 h。

1.3.3樣品測定

1.3.3.1色譜條件

色譜柱：Agilent HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：180 ℃保持1 min，以15℃/min升至200 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min升至290 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1 mL/min；前進樣口溫度250 ℃；壓力81.4 kPa，進樣量1 μL，不分流。

1.3.3.2質譜條件

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時間5 min。質量掃描范圍m/z 50～500；根據保留時間和特征性離子m/z 279、167、149對DEHP定性；選擇離子監測模式，m/z 167為定量離子。

1.3.4方法學考察

1.3.4.1標準曲線繪制

取空白血清加入DEHP標準溶液，得到DEHP系列質量濃度：0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg/mL，進行GC-MS分析后，以定量離子m/z 167色譜峰高為縱坐標，系列標準質量濃度為橫坐標，進行線性回歸分析。

1.3.4.2精密度與回收率測定

空白血清添加DEHP標準品，使DEHP終質量濃度為0.1、1.0、5.0 μg/mL，每個質量濃度重復3 個樣品，然后以1.3.2節樣品處理方法進行前處理及1.3.3節方法進行測定，計算血清加入標準品實測峰高與相應標準品峰高比值，得到絕對回收率。同一天、同一批樣品重復3 次，連續3 d，測得其日內和日間精密度，以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

1.3.4.3方法靈敏度

通過加標實驗，以0.1 μg/mL的添加質量濃度進樣3 次，以信噪比（signal to noise ratio，RSN）等于10來計算最低定量限（limit of quantification，LOQ），以RSN等于3計算最低檢測限（limit of detection，LOD）。

1.4藥代動力學參數分析

2　結果與分析

2.1標準曲線

線性回歸方程為Y=99 411X-6 195.4，R2= 0.999 4。通過標準曲線的繪制可以看出本分析方法在DEHP質量濃度較寬的范圍內具有較好的線性關系。

2.2方法精密度和回收率

表1　小鼠空白血清添加DEHP的回收率和精密度Table1Recoveris and precision of DEHP spiked in mouse serum

表1　小鼠空白血清添加DEHP的回收率和精密度Table1Recoveris and precision of DEHP spiked in mouse serum

添加質量濃度/（μg/mL）日內日間絕對回收率/%RSD/%絕對回收率/%RSD/% 0.164.23±6.219.6765.78±5.908.97 171.01±5.187.2970.54±3.765.34 574.87±2.162.8973.01±2.753.7 8

如表1所示，實驗的絕對回收率在64.23%～74.87%之間，RSD均小于10%。本實驗對固相萃取條件進行了優化，在固相萃取的洗脫過程中，若洗脫劑的濃度選擇不當會使目標物脫附，回收率降低。洗脫曲線實驗結果顯示，10%、30%、50%的甲醇洗脫小柱，均未在洗脫流出液中檢測到DEHP，達到60%時目標物被檢測到?？紤]到血清樣品直接過柱處理，選擇甲醇梯度洗脫，逐漸增加溶劑強度以避免血清蛋白沉淀堵塞小柱。在預實驗階段，50%甲醇可以使血清出現少許絮狀沉淀，故未選擇50%甲醇做一步洗脫。

在選擇洗脫溶劑時，直接用100%甲醇一次洗脫目標物時，發現小柱仍有目標物未被洗脫，而10%甲醇-甲基叔丁基醚洗脫效果很好，故選用10%甲醇-甲基叔丁醚作為洗脫劑。本方法采用血清樣品直接稀釋過柱，簡便易行，回收率較好。

2.3方法靈敏度

結果顯示最低檢測限LOD = 0.004 μg/mL，最低定量限LOQ = 0.013 μg/mL，表明該測定方法的靈敏度較好。

2.4血藥質量濃度-時間曲線

圖1　DEHP在小鼠體內平均血藥質量濃度--時間曲線Fig.1Average concentration-time curve of DEHP in mouse serum

如圖1所示，血藥質量濃度-時間曲線顯示，DEHP口服吸收速率較快，在給藥后3 h，DEHP的血藥質量濃度達到最大，為（0.782±0.105）μg/mL。在第48小時，DEHP仍維持較高的質量濃度，暗示其體內消除速率較慢。

2.5DEHP動力學特點

以AIC（Akaike’s Information Criterion）值和WSS（加權殘差平方和）為指標，AIC和WSS越小，擬合程度越好。結果表明：以權重為1/ρ2時，擬合為一級吸收二室開放模型較好，相關參數見表2。分布半衰期t1/2α為（1.886±0.480）h，消除半衰期t1/2β為（36.473±8.324）h，表明DEHP在體內分布較快，而代謝較慢，暗示DEHP在體內有較強的蓄積性。擬合的藥物動力學方程為ρt=1.6e-0.386t+0.256e-0.019t。

表2DEHP在青春期小鼠體內代謝的主要動力學參數Table2Major pharmacokinetic parameters of DEHP in pubertal mice

注：A.分布相初始質量濃度；B.消除相初始質量濃度；α.分布相速率常數；β.消除相速率常數；Ka.吸收速率常數；K10.轉運速率常數；t1/2α.分布半衰期；t1/2β.消除半衰期；t1/2Ka.吸收半衰期；K21.周邊室至中央室轉運速率常數；K12.中央室至周邊室轉運速率常數；AUC（0-t）.藥-時曲線下面積；CL.清除率；Tpeak.達峰時間；ρmax.達峰質量濃度。

DEHP分布半衰期為（1.886±0.480）h，消除半衰期為（36.473±8.324）h，表明DEHP在小鼠體內吸收較快，而消除較慢，說明DEHP易在小鼠體內蓄積。有學者的研究表明：人類口服DEHP后2 h其一級代謝產物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP）達到最大值，24 h后，約67%的DEHP代謝至尿液中，另外有3.8%的DEHP在第2天代謝至尿液中，與DEHP在人體內吸收較快而消除較慢的結論基本一致[19-20]。

因此，研究DEHP在小鼠各組織中的消長規律，建立準確可靠的DEHP在小鼠體內的生理藥物代謝動力學模型，獲得生理藥物代謝動力學模型的參數，驗證所建立的生理模型并進行生理模型的種屬（人）間外推，通過生理模型建立DEHP在靶組織殘留的預測模式以保護人類健康顯得尤為重要[21]。本研究的結果表明，DEHP灌胃內服后在小鼠體內符合二室開放模型，分布半衰期約為1.9 h，消除半衰期約為36.5 h，認為該化合物是一種長半衰期毒物，而且測得DEHP在體內分布相速率常數α約為消除相速率常數β的20 倍，表明該化合物在體內具有分布過程較快、消除過程慢的特征。同其他成年哺乳動物比較，DEHP在青春期小鼠體內的消除半衰期較長，其原因有待進一步研究[22-25]。

肥胖及其相關的代謝性疾病已經成為人類健康的主要殺手。由于DEHP是一種脂溶性物質，更容易囤積在脂肪細胞內，因此，肥胖者體內更容易發生DEHP蓄積，也更容易受到其類雌激素作用的影響。開展DEHP在青春期肥胖模型小鼠體內的代謝動力學過程研究具有深遠意義。

3　結論

本實驗測定方法采用血清樣品直接稀釋過柱，簡便易行，所獲得的模型線性關系、回收率和精密度較好。DEHP在青春期小鼠體內代謝動力學過程符合一級吸收二室開放模型，分布半衰期約為1.9 h，消除半衰期約為36.5 h，DEHP在青春期小鼠體內的代謝符合分布快、消除慢的特征。

[1] GEVAO B, AL-GHADBAN A, BAHLOUL M, et al. Phthalates in indoor dust in Kuwait: implications for non-dietary human exposure[J]. Indoor Air, 2013, 23(2): 126-133.

[2] ZHANG Rongfei, WANG Weili, SHI Xiaorong, et al. Health risk of semi-volatile organic pollutants in Wujin river inflow into Taihu Lake[J]. Ecotoxicology, 2011, 20(5): 1083-1089.

[3] 趙宇翔, 黃玉翠. ASE萃取-氣相色譜/質譜法測定化妝品包裝材料中增塑劑的含量[J]. 香料香精化妝品, 2013(3): 47-49.

[4] 林鈮, 靳洪濤, 王愛平. 醫療器械中增塑劑的應用和安全性研究進展[J]. 中國藥物警戒, 2014, 11(2): 100-103.

[5] 高松, 王志偉, 胡長鷹, 等. 紙包裝油墨中增塑劑向奶粉的遷移[J].食品科學, 2014, 35(1): 18-22.

[6] BUSER M C, MURRAY H E, SCINICARIELLO F. Age and sex differences in childhood and adulthood obesity association with phthalates: analyses of NHANES 2007-2010[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2014, 217(6): 687-694.

[7] SUI Haixia, ZHANG Lei, WU Pinggu, et al. Concentration of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in foods and its dietary exposure in China[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2014, 217(6): 695-701.

[8] WU Chiafang, CHANG-CHIEN Guoping, SU Shengwen, et al. Findings of 2731 suspected phthalate-tainted foodstuffs during the 2011 phthalates incident in Taiwan[J]. Journal of the Formosan Medical Association, 2014, 113(9): 600-605.

[9] 楊春英, 劉學銘, 徐玉娟. 果汁飲料中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的測定及其來源分析[J]. 食品科學, 2013, 34(10): 259-262.

[10] 蔡晶, 柴麗月, 胡秋輝. 食品中鄰苯二甲酸酯的檢測及安全評價[J].食品科學, 2005, 26(12): 242-245.

［11］TEIL M J，TLILI K，BLANCHARD M，et al.Polychlorinated biphenyls，polybrominated diphenyl ethers，and phthalates in roach from the Seine River basin（France）：impact of densely urbanized areas［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2014，66（1）：41-57.

[12] 時國慶, 李棟, 盧曉坤, 等. 環境內分泌干擾物質的健康影響與作用機制[J]. 環境化學, 2011, 30(1): 211-223.

[13] 趙力軍, 沈晟, 王靜, 等. 鄰苯二甲酸二辛酯對大鼠卵巢顆粒細胞分泌功能的影響[J]. 中國工業醫學雜志, 2012, 25(4): 278-280.

[14] EVEILLARD A, LASSERRE F, de TAYRAC M, et al. Identifi cation of potential mechanisms of toxic ity after di-(2-ethylhexyl)-phthalate (DEHP) adult exposure in the liver using a systems biology approach[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2009, 236(3): 282-292.

[15] 陳文婕, 戴紅, 陳敏, 等. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對小白鼠肝臟毒性及脂質過氧化損傷[J]. 生態毒理學報, 2012, 7(1): 93-98.

[16] 方鑫, 李海玲, 胡月玲, 等. 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對小鼠腎臟損害及氧化應激機制的研究[J]. 中國預防醫學雜志, 2014, 15(1): 8-12.

[17] 肖延風. 內分泌干擾物對兒童青春期發育的影響[J]. 中國兒童保健雜志, 2013, 21(3): 230-231.

[18] 王紅, 郝加虎, 陶芳標. 環境內分泌干擾物與青春發動時相提前[J].實用兒科臨床雜志, 2009, 24(20): 1604-1606.

[19] 林興桃, 王小逸, 呂文濤, 等. 鄰苯二甲酸酯代謝研究進展[J]. 環境與健康雜志, 2009, 26(2): 182-184.

[20] KOCH H M, BOLT H M, PREUSS R, et al. New metabolites of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in human urine and serum after single oral doses of deuterium-labelled DEHP[J]. Archives of Toxicology, 2005, 79(7): 367-37 6.

[21] 陳琳, 錢青, 張喆, 等. 醫療途徑中增塑劑DEHP的溶出及其安全性研究概況[J]. 中國藥房, 2011, 22(33): 3073-3075.

[22] LJUNGVALL K, TIENPONT B, DAVID F, et al. Kinetics of orally administered di (2-ethylhexyl) phthalate and its metabolite, mono (2-ethylhexyl) phthalate, in male pigs[J]. Archives of Toxicology, 2004, 78(7): 384-389.

[23] SJ?BERG P, BONDESSON U, SEDIN G, et al. Dispositions of diand mono-(2-ethylhexyl) phthalate in newborn infants subjected to exchange transfusions[J]. European Journal of Clinical Investigation, 1985, 15(6): 430-436.

[24] KLUWE W M. Overview of phthalate ester pharmacokinetics in mammalian species[J]. Environmental Health Perspectives, 1982, 45: 3-9.

[25] 孫俊紅, 張克榮, 吳德生. 鄰苯二甲酸酯在兔體內的毒代動力學[J].環境與健康雜志, 2004, 21(4): 213-214.

Pharmacokinetics of Di-（2-ethylhexyl）phthalate in Pubertal Mice

ZHANG Dan，YE Kui，WANG Jiajia，XU Hai，SONG Xingxing，JIN Zhongxiu，SHENG Jie，LI Li，LIU Kaiyong*
（School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei230601，China）

A pharmacokinetic study of di-（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）was carried out in pubertal mice.The serum of pubertal mice was collected after oral administration of DEHP at a dose of300mg/kg，and DEHP was extracted from the serum samples and purified by solid phase extraction（SPE）.The DEHP concentrations in serum at different time points were assayed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）and the pharmacokinetic parameters were calculated by3p97software.The major pharmacokin etic parameters of DEHP in pubertal mice were obtained as follows：ρmax（0.476±0.028）μg/mL，Tpeak（2.539±0.424）h，AUC（0-t）（32.209±11.220）h·μg/mL， t1/2α（1.886±0.480）h，and t1/2β（36.473±8.324）h.The method presented is sensitive，accurate and fast，and can meet the requirements for the pharmacokinetic study of DEHP in pubertal mice.The pharmacokinetics of DEHP in pubertal mice was found to be fitted to a two-compartment open model with first order absorption and DEHP reveals the quick distribution and slow elimination.

pharmacokinetics；gas chromatography-mass spectrometry；solid-phase extraction；di-（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）

R155.5

A

1002-6630（2015）05-0185-04

10.7506/spkx1002-6630-201505035

2014-05-04

安徽省高校省級自然科學研究項目（KJ2012Z168）；安徽醫科大學中青年學術骨干資助基金項目（2012051）；安徽醫科大學博士科研基金項目（XJ201112）

張丹（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品衛生學。E-mail：zhangdan2148@163.com

劉開永（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品衛生學。E-mail：liukaiyong163@163.com