硫酸氨基葡萄糖對口服透明質酸緩解小鼠佐劑性關節炎的增效作用

杭興偉，增田泰伸，木村守，臼田美香，王　唯，陳　潔，張曉安，奚印慈，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.日本丘比株式會社，東京1500002）

硫酸氨基葡萄糖對口服透明質酸緩解小鼠佐劑性關節炎的增效作用

杭興偉1，增田泰伸2，木村守2，臼田美香2，王唯2，陳潔1，張曉安1，奚印慈1，*

（1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.日本丘比株式會社，東京1500002）

目的：探討硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）對口服透明質酸（hyaluronic acid，HA）緩解小鼠佐劑性關節炎的增效作用。方法：將50只8周齡ICR雄性小鼠隨機分成5組：正常組、模型組、HA組、GS組和HA+GS組。除正常組以外，其余4組小鼠左后足注射弗氏完全佐劑（freund’s complete adjuvant，FCA）建立佐劑性關節炎模型，然后進行4周的HA和GS口服給藥，并分別對小鼠體質量、足跖腫脹度進行測定，同時采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測小鼠血清中白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。結果：口服HA和GS都能夠減輕小鼠的足跖腫脹度，而同時口服HA和GS能起到更好的消腫效果，血清中IL-1及TNF-α的含量也顯著降低。結論：給予小鼠口服HA+GS，比單獨服用HA、GS能更有效、更快地緩解小鼠的足跖腫脹癥狀，同時能夠降低血清中IL-1及TNF-α含量，進而對小鼠佐劑性關節炎起到更好的治愈效果。

口服透明質酸；口服硫酸氨基葡萄糖；佐劑性關節炎

關節炎是一種由于關節磨損退化而引起的慢性關節疾病，隨著年齡的增長，其發病率會逐漸上升。關節炎患者通常會有關節組織水腫、關節僵硬、活動受限等癥狀，他們的日常生活也因此受到了困擾。根據相關研究報道，關節炎的病因主要與關節內透明質酸（hyaluronic acid，HA）的降解有關，因此HA在關節炎病理機制中的作用受到了廣泛關注［1］。

透明質酸是存在于人體關節軟骨和滑液中的一種多糖成分，主要由關節軟骨細胞和滑膜細胞分泌，在人體關節內有一定的生理功能，有利于緩解關節炎癥狀［1］：1）關節液內的HA具有黏彈性，能夠保護軟骨組織不受損，并對傷害性感受器的膜起到穩定作用，減少疼痛感；2）HA在軟骨內能夠形成一道屏障，抵擋炎性介質侵入，防止組織受到破壞；3）滑膜內HA含量的升高能對炎性細胞起到抑制作用，減輕滑膜炎癥。國內已有實驗報道：口服透明質酸能夠降低關節炎指數，并通過促進體內HA含量的升高，有效地緩解了關節炎癥狀［2］。目前，透明質酸已經被國家衛生部認定作為新資源食品的一種。

硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）作為一種天然活性物質，主要存在于人體的結締組織和軟骨基質中，是滑液中聚氨基葡萄糖的主要成分，在關節內能夠發揮一定的生理功能，主要是刺激關節軟骨的蛋白聚糖合成及抑制其分解［3］。如今，硫酸氨基葡萄糖在醫藥及保健品領域得到了廣泛的應用，相關專家已認可并將其列為具有保健功能的健康食品之一；硫酸氨基葡萄糖于2000年被衛生部門批準為保健食品［4］。

國內已有許多臨床實驗研究報道［5］，口服硫酸氨基葡萄糖聯合關節內注射透明質酸能夠起到抑制關節炎惡化的效果，但由于關節內注射HA在實際操作中不方便，長期注射可能會給患者的關節造成一些負面影響，從而使患者產生畏懼感。因此，本研究以透明質酸和硫酸氨基葡萄糖為材料，通過建立小鼠佐劑性關節炎模型，探究在透明質酸中加入硫酸氨基葡萄糖后，聯合口服二者對佐劑性關節炎癥狀的緩解效果，并試圖為患者確立一種安全、便利、有效的聯合用藥新途徑。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

ICR雄性小鼠50只，8周齡，體質量約30g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；清潔級顆粒鼠糧、清潔級墊料江蘇協同醫藥生物工程有限公司。

透明質酸（相對分子質量約為1.0×106，純度≥95%）日本丘比株式會社；硫酸氨基葡萄糖膠囊（維固力）羅達藥廠。

弗氏完全佐劑（freund’s complete adjuvant，FCA）美國Chondrex公司；乙醇、氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司；小鼠白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒上海撫生實業有限公司。

1.2儀器與設備

YP5002電子天平上海佑科有限公司；CT14RD臺式高速冷凍離心機上海天美儀器有限公司；游標卡尺杭州瑞騰精測食品有限公司；550型酶標儀美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1動物分組與關節炎模型建立

ICR雄性小鼠50只分為5組，每組10只：正常組、模型組、HA組、GS組和HA+GS組。在恒溫條件下適應性飼養一周，自由飲食、飲水。

將弗氏完全佐劑（FCA）和蒸餾水以1∶1（V/V）均勻混合后充分乳化，用1mL注射器吸取乳化好的FCA，然后分別對模型組、HA組、GS組以及HA+GS組小鼠左后足跖注射0.1mL FCA進行關節炎造模，同時對正常組小鼠左后足跖注射等劑量的生理鹽水。

1.3.2透明質酸與硫酸氨基葡萄糖的制備

透明質酸（HA）的制備：將粉末狀的HA和蒸餾水混合，配制成質量濃度為12mg/mL液體狀的HA，并通過磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的HA溶液，每天配制一次，現配現用。

硫酸氨基葡萄糖（GS）的制備：將粉末狀的GS和蒸餾水混合，配制成質量濃度為6mg/mL液體狀的GS，并通過磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的GS溶液，每天配制一次，現配現用。

透明質酸和硫酸氨基葡萄糖混合液（HA+GS）的制備：將粉末狀的HA和GS與蒸餾水混合，配制成每毫升含有12mg HA和6mg GS的混合液，并通過磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的HA+GS混合溶液，每天配制一次，現配現用。

1.3.3小鼠口服給藥處理

正常組：其余組小鼠造模后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL生理鹽水，每天一次，連續4周。模型組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL生理鹽水，每天一次，持續4周。HA組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL HA，每天一次，持續4周。GS組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL GS，每天一次，持續4周。HA+GS組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL HA+GS混合液，每天一次，持續4周。

1.3.4小鼠體質量測定

在適應性飼養期間，每天稱取小鼠體質量，并做記錄。在適應性飼養的最后一天，根據小鼠的體質量，將其分為體質量相近的5組進行關節炎實驗。在實驗期間，每天一次稱體質量，記錄各組小鼠體質量的變化情況。

1.3.5小鼠足跖腫脹度的測定

小鼠足坧腫脹度的測量：實驗開始前（即適應性飼養的最后一天，計為第0天），在每只小鼠左、右足跖同一處做好標記，在標記處用游標卡尺對足跖厚度和寬度進行測量，并將測得的厚度和寬度相乘，即得到初始足跖腫脹度。每隔10d（第10、20、30天時）測量一次足跖腫脹度，并將第10、20、30天時測得的腫脹度數值與初始足跖腫脹度相減，即得到足跖腫脹度變化值。

圖像采集：在第30天，利用數碼相機對各組小鼠注射足的足跖部位進行拍攝，并進行組別間對比。

1.3.6血清中免疫學指標的含量測定

5組小鼠按照1.3.3節方法口服給藥4周后，從小鼠背部大動脈及心臟中取血置于無菌EP管中，5000r/min離心15min，取上清液，按照IL-1及TNF-αELISA試劑盒說明書用酶標儀進行檢測（如果暫時不檢測，可將上清液移至另一無菌EP管中，-20℃保存待測）。

1.4統計學分析

所有數據都采用SPSS20.0軟件處理，通過Tukey’s test進行顯著性差異分析，結果均以±s表示。

2　結果與分析

2.1口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠的一般影響

模型組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠在注射FCA后，左足跖都出現紅腫現象，與正常組小鼠相比，行動變得遲緩，飲食略微減少，體質量增長也開始減緩。其中，模型組小鼠的左足跖腫脹現象不斷惡化，而HA組、GS組和HA+GS組小鼠在經過一段時間的口服給藥之后，左足跖及腳踝的腫脹情況得到了不同程度的緩解，飲食、體質量等各項指標都得到了有效改善。

2.2口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠體質量變化的影響

圖1　口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠體質量的影響Fig.1Effect of HA and GS on body weight in mice with adjuvant arthritis

如圖1所示，各組小鼠經過一周的適應性飼養后，基本都保持在同一生長狀態，因此各組小鼠的初始體質量變化為0，之后建立模型并對各組小鼠口服給藥，此時計為第0天，觀察給藥28d內各組小鼠體質量的變化情況。在0～7d內，模型組小鼠體質量差值出現負增長，并且與HA組、GS組、HA+GS組存在顯著差異（P＜0.05），這可能是由于關節炎給小鼠帶來疼痛感，從而極大地影響了它們的生長狀態，導致體質量有略微下降；而正常組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠體質量差值都呈現增長趨勢，其中HA、GS和HA+GS組小鼠雖然患有關節炎癥，但體質量并未下降，這可能是由于這3組小鼠經過藥物治療后，炎癥得到了一定緩解的作用，從而使體質量呈現緩慢的增長趨勢，但增長的速率略低于正常組。

在7～28d內，HA組、GS組和HA+GS組小鼠體質量始終保持著持續增長狀態，而HA+GS組小鼠體質量的增長速率略高于HA組和GS組，但并未出現顯著性差異（P＞0.05）。在14～28d內，模型組小鼠體質量也呈現增長趨勢，并且與HA組、GS組不存在顯著差異（P＞0.05）。從食用飼料的情況來看，模型組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠的食用量相近（模型組914.97g、HA組993.96g、GS組988.47g、HA+GS組980.6g）。而在7～28d內，各組小鼠體質量都有明顯的增長趨勢，這在一定程度上可以說明飼料的食用情況并未對小鼠的生長狀態產生較大影響，在給藥期間的大部分時間內，各組小鼠體質量都保持著增長的狀態。

2.3口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠足跖腫脹度的影響

圖2口服給藥28d后各組佐劑性關節炎小鼠左足跖的腫脹情況Fig.2Swelling status of the left paw mice with adjuvant arthritis after oral administration for28days

如圖2所示，通過圖像采集結果發現，模型組小鼠左足跖腫脹情況最為顯著。與模型組相比，HA組、GS組和HA+GS組則有不同程度的消腫跡象；與HA組和GS組比較，在HA中加入GS后（HA+GS組）給予小鼠口服的效果更為明顯。

圖3口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠左足跖腫脹度的影響Fig.3Effect of HA and GS on the swelling degree of the left paw in mice with adjuvant arthritis

圖4口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠右足跖腫脹度的影響Fig.4Effect of HA and GS on the swelling degree of the right paw in mice with adjuvant arthritis

如圖3所示，將適應性飼養的最后一天計為第0天，在第10天，模型組、HA組、GS和HA+GS組小鼠的左足跖都出現明顯的腫脹現象，其中模型組最為顯著，左足跖腫脹度變化值顯著高于HA組、GS組和HA+GS組（P＜0.05），這表明小鼠在注射了FCA后，其左足跖產生了炎癥反應。如圖4所示，模型組小鼠右足跖的腫脹度也有一定程度的增長，但增長趨勢較為緩慢，到第30天時，模型組與HA組、GS組和HA+GS組間相比表現出一定的差異，但與左足跖相比，腫脹度的變化并不明顯。在注射FCA后的第20天，模型組小鼠的左足跖腫脹度變化值達到峰值，而HA組、GS組和HA+GS組小鼠左足跖腫脹度則呈現不同程度的下降趨勢，其中HA+GS組小鼠左足跖的腫脹度變化值低于HA組和GS組，且與HA組比較，存在顯著差異（P＜0.05）。而HA組、GS組和HA+GS組與模型組之間也都存在顯著差異（P＜0.05）。到第30天，模型組小鼠左足跖出現略微的消腫現象，而HA組、GS組和HA+GS組的左足跖腫脹度變化值則繼續減小，其中HA+GS組最為明顯，腫脹度變化值遠低于HA組和GS組，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

在HA中加入GS后，給予小鼠口服4周內，HA+GS組小鼠左足跖腫脹度變化值始終低于HA組和GS組，且腫脹度的減小速率大于這兩組，并在第20天時就表現出顯著差異（P＜0.05）。而HA組和GS組小鼠左足跖腫脹度變化值的減小速率相近，且二者之間不存在顯著差異（P＞0.05）。2.4口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠血清中IL-1含量的影響連續口服給藥4周后，對各組小鼠血清中IL-1的含量進行檢測，觀察各組之間的差異。如圖5所示，模型組小鼠血清中IL-1的含量與正常組相比顯著升高，HA組、

圖5口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠血清中IL-1含量的影響Fig.5Effect of oral administration of HA and/or GS by on serum IL-1level in mice with adjuvant arthritis

GS組和HA+GS組小鼠在口服HA和GS后，血清中IL-1

的含量都明顯降低，且與模型組相比，都存在顯著差異（P＜0.05）。其中HA+GS組表現更為明顯，與HA組比較，存在顯著差異（P＜0.05）。以正常組為基準，計算其余4組IL-1含量的增長率：模型組為156.23%、HA組為

57.79%、GS組為53.00%、HA+GS組為27.51%。

2.5口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠血清中TNF-α含

量的影響

圖6口服HA和GS對佐劑性關節炎小鼠血清中TNF-TNF-α含量的影響Fig.6Effect of oral administration of HA and/or GS by on serum TNF-αlevel in mice with adjuvant arthritis

經過4周的口服給藥后，檢測各組小鼠血清中TNF-α的含量，比較各組之間的差異。如圖6所示，模型組小鼠血清中TNF-α的含量與正常組相比顯著升高，HA、GS和HA+GS組小鼠在口服HA和GS后，血清中TNF-α的含量都明顯降低，且與模型組相比都存在顯著差異（P＜0.05）。其中HA+GS組最為顯著，與其余3組之間存在顯著差異（P＜0.05）。

3　結論與討論

透明質酸是構成人體內關節軟骨和滑液的主要成分，是由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖構成的雙糖單位連接而成的高分子黏性多糖。它在人體關節內能起到保護軟骨以及合成滑膜內HA的作用［6］。而硫酸氨基葡萄糖是存在于機體內關節軟骨中的氨基單糖。據報道，GS所產生的無機硫酸基團可以控制多聚氨基葡萄糖和蛋白多糖的合成，從而保護和修復受損的軟骨基質和軟骨細胞［7］；另外，補充外源性的硫酸氨基葡萄糖還可以調節膠原酶和磷脂酶A2的活性，減少損傷軟骨細胞的內毒性因子釋放，對軟骨內多聚氨基葡萄糖的代謝起到促進和平衡的作用。

在關節炎發病機理過程中，IL-1被認為是最核心的炎癥因子，它的表達程度與關節炎的嚴重程度呈正相關。IL-1可通過不同途徑引起關節軟骨退變、破壞及降解：1）IL-1對基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的異常調控是導致軟骨破壞的主要途徑之一，MMPs對軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖都具有高度的裂解活性，能夠降解軟骨外基質，進而破壞軟骨組織［8］；2）在滑膜細胞中，IL-1的表達增加，對滑膜炎癥起著促進作用，進一步增加了炎癥因子以及MMPs的產生，從而破壞軟骨組織，加速關節炎的發展；3）刺激TNF-α、一氧化氮等炎癥因子的高度表達，加劇軟骨細胞的凋亡，并且IL-1與TNF-α之間有著協同作用，共同促進軟骨細胞分泌纖維蛋白溶酶原激活劑，使纖維蛋白溶酶原轉換成纖維蛋白溶酶而降解纖維蛋白，加速膠原的分解代謝，這些均可造成軟骨的損傷［9-11］。所以IL-1和TNF-α可作為評判關節炎病情的重要指標。已有實驗研究證明［12-15］，關節炎患者血清中IL-1和TNF-α的含量明顯高于健康人群。因此通過測定血清中IL-1和TNF-α的含量，可以初步判斷關節炎的嚴重程度。而本實驗也證實模型組小鼠血清中IL-1和TNF-α的含量遠高于正常組。

經過口服外源性透明質酸后，HA會與小腸上皮細胞中HA接收器Toll樣受體-4（toll-like receptor-4，TLR-4）結合，刺激細胞因子信號傳導抑制因子3（suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）的表達，通過SOCS3的引導，產生抑炎癥因子IL-10，抑制IL-1的表達；IL-10作為重要的抗炎Th2型細胞因子，能夠通過抑制核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）進而抑制TH1細胞產生TNF-α，控制其對軟骨的破壞［16-17］。另外，HA本身具有清除關節滑液內自由基的功能，調節關節內巨噬細胞吞噬作用及白細胞趨化性，從而抑制關節內的炎癥反應，阻止關節軟骨的退化［18-21］。

硫酸氨基葡萄糖作為一種小分子化合物，口服之后，在小腸中被分解為氨基葡萄糖和硫酸根離子。硫酸根離子對軟骨中蛋白多糖的合成能起到一定的作用；同時氨基葡萄糖能通過載體擴散進入軟骨細胞，抑制與IL-1調控的相關酶，從而下調IL-1的表達；由于IL-1與TNF-α之間有著協同作用，IL-1的表達下降在一定程度上也導致TNF-α的表達降低，進而減緩炎癥的惡化［22］。而在軟骨表面，GS還有阻斷與IL-1表達相關的信號途徑的作用，主要是抑制NF-κB的活性，同時促進非活性的IL-1受體，使之與IL-1相結合，阻斷信號傳導產生炎癥效應［22］。國外已有研究報道［23］，關節炎發生會導致軟骨內蛋白多糖的含量減少。從理論上說，口服外源性GS能夠刺激關節軟骨內蛋白聚糖的合成，并且抑制某些破壞軟骨的酶的產生，從而下調TNF-α的表達［24］。但具體機制尚未發現，有待進一步研究論證。本實驗結果表明，GS組小鼠血清中IL-1以及TNF-α的含量遠低于模型組，且它們之間存在顯著差異（P＜0.05）。

在本實驗中，小鼠作為研究對象，由于其個體過小，一部分關節測量的效果并不十分明顯，但通過分析小鼠的各項指標發現，單獨給予HA或GS都能對關節炎癥狀起到一定的緩解效果，但它們之間不存在顯著性差異（P＞0.05），這說明，單獨口服HA或GS，對關節炎癥狀的緩解有著相似的效果。在HA中加入GS后給予小鼠口服，不僅使HA在小鼠小腸內產生免疫反應，下調炎性介質的表達，而且還保留了HA在關節內的生理功能，抑制炎癥的進一步惡化；同時GS通過小腸分解，形成硫酸根離子和氨基葡萄糖，在軟骨表面發揮不同的作用，硫酸根離子能促進蛋白多糖的合成，起到穩定軟骨組織結構的作用。而氨基葡萄糖則協同HA抑制炎癥因子的高度表達，對軟骨進行有效保護，促進緩解炎癥，有效地抑制了軟骨退化。已有很多臨床研究報道［25-30］，采用口服硫酸氨基葡萄糖聯合關節腔內注射透明質酸對關節炎患者進行治療，結果在各項評價指標中都得到了良好的效果，并且優于單獨口服GS或關節腔內注射HA，同時兩者聯合治療的療效持久、治愈率高；但關節注射可能會給患者帶來不必要的疼痛，使患者產生心理負擔。因此在本次研究中，通過口服的方式，將GS添加到HA中，給予小鼠食用，結果對足跖腫脹度差值結果的分析發現：在口服HA和GS后的第20天，HA+GS組就與HA組有顯著性差異，而到了第30天與HA組和GS組都存在差異（P＜0.05）。以上結果表明：GS加快了HA緩解關節炎癥狀的作用，并增強了這種療效的持久性。

給小鼠單獨口服HA和GS，在一定程度上能夠緩解其關節炎癥狀。而在HA中添加GS后給小鼠口服，不僅保留了HA抑制關節炎癥的功能特性，同時還發揮了GS對軟骨的保護作用，更有效地減輕了小鼠足跖腫脹度以及降低了相關炎癥因子IL-1及TNF-α的含量，對關節炎起到了更為顯著的治愈效果。

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［30］李亞芹.透明質酸鈉聯合硫酸氨基葡萄糖治療膝骨關節炎的療效分析［J］.中國醫藥指南，2011，9（15）：260-261.

Synergism of Glucosamine Sulfate in Relieving Effect of Hyaluronic Acid by Oral Administration on Mice with Adjuvant Arthritis

HANG Xingwei1，YASUNOBU Masuda2，MAMORU Kimura2，MIKA Usuda2，WANG Wei2，CHEN Jie1，ZHANG Xiaoan1，XI Yinci1，*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；2.Japan Kewpie Corporation，Tokyo1500002，Japan）

Aim：To explore the synergism of glucosamine sulfate（GS）with hyaluronic acid（HA）by oral administration in relieving adjuvant arthritis in mice with.Methods：Fifty8-week-old ICR male mice were randomly divided into5groups at random with an equal number of animals in each group：normal，model，HA，GS，and HA+GS groups.Except normal group，the animal models with adjuvant arthritis from4other groups were established by injecting0.1mL of Freund’s complete adjuvant（FCA）into the left rear paw，followed by oral administration of HA and/or GS for4weeks.The body weights and swelling degree of mouse rear feet were evaluated respectively.The serum concentration of IL-1and TNF-α in mice were detected by enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Swelling degree of mouse feet could be inhibited by oral administration of HA or GS，and this inhibitory effect was more pronounced when both compounds were administrated.In addition，an obvious decrease in IL-1and TNF-αlevels in serum was observed.Conclusion：In addition to decreasing serum IL-1and TNF-αlevels，HA and GS could alleviate the swelling of mouse feet more effectively and rapidly when used in combination than when used individually，so that exerting a better curative effect on mouse arthritis.

oral administration of hyaluronic acid；oral administration of glucosamine sulfate；adjuvant arthritis

TS201.2

A

1002-6630（2015）05-0189-06

10.7506/spkx1002-6630-201505036

2014-07-01

上海海洋大學-日本丘比株式會社合作研究基金項目

杭興偉（1989—），男，碩士研究生，研究方向為天然物質對關節炎的療效。E-mail：Strongb@126.com

奚印慈（1957—），女，博士，研究方向為天然物質的生物活性。E-mail：ycxi@shou.edu.com