熒光納米材料應用于蛋白質分析的研究進展

王琪，王蓓蓓，馬美湖，蔡朝霞*

（國家蛋品加工技術研發分中心，華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

熒光納米材料應用于蛋白質分析的研究進展

王琪，王蓓蓓，馬美湖，蔡朝霞*

（國家蛋品加工技術研發分中心，華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

蛋白質與人體新陳代謝、免疫應答和疾病發生等密切相關，因此對蛋白質研究是當今世界共同關注的熱點，目前已經滲透到生物、醫學、食品等各個領域。納米技術的發展極大地促進了蛋白質技術的研究，發展光學特性優良、生物相容性好的功能化熒光納米材料對深入研究蛋白質的標記、分析以及分離具有非常重要的意義。本文主要介紹了半導體量子點、嵌入式核殼熒光納米顆粒、碳點、碳納米管、貴金屬元素納米簇和磁性熒光納米顆粒等熒光納米材料的基本性質，以及各種熒光納米材料在蛋白質標記成像、蛋白質相互作用、蛋白質固定與分離以及蛋白質分析檢測方面的應用。

熒光；納米材料；蛋白質；應用

蛋白質是構成生命體的基礎物質，在生物體內起著重要作用，參與幾乎所有的生命活動，如催化生命體內各種反應進行、調節代謝、抵御外來物質入侵及控制遺傳信息等［1］。蛋白質與人體的新陳代謝、免疫應答反應和疾病的發生等都有密切的關系。因此，蛋白質研究在食品檢驗、臨床檢驗和疾病診斷等方面都具有重要意義。

目前，多種方法已被用于蛋白質研究方面。隨著納米科學技術的發展，納米材料也越來越多被用在蛋白質的研究領域。熒光納米材料由于其獨特的結構，具有一些不同于常規材料和單個分子的特殊性質，尤其是特殊的熒光性質，使其在光學、生物和醫藥等諸多方面有重要的應用價值［2］。本文重點對多種熒光納米材料在蛋白質研究方面的進展進行綜述，總結了目前用于蛋白質研究的主要納米材料的特點及其在蛋白質標記成像、相互作用、固定與分離以及痕量分析檢測方面的基本應用。

1　用于蛋白質研究的常見熒光納米材料

1.1熒光納米材料的基本性質

納米材料，是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（＜100nm）或由該尺度范圍的物質作為基本單元構成的材料。納米材料的特殊結構，使其具有不同于常規材料和單個分子的一些特性，主要包括比表面積大、高化學活性、特殊的光、電、磁性質等［3］。而熒光納米材料，由于其特殊的結構與光學特性，為化學、物理、醫學和生物領域的發展帶來了新的機遇。

傳統的熒光材料激發光譜較窄，熒光特征譜較寬且分布不對稱，光解產物可能對生物體產生殺傷作用。并且由于其本身性質，存在光穩定性差，容易被光漂白等缺陷。另外，作為熒光探針，傳統熒光材料存在分析靈敏度低、親水性差等缺陷［4］，限制了其在生物、醫學等許多方面的應用。而熒光納米材料不僅具有較高的熒光強度和優越的光穩定性，而且可以通過控制合成條件，使一些結構特殊的熒光納米材料具有尺寸依賴的光學特征，有利于蛋白質的同步分析［5］；當納米材料的發光達到近紅外光譜范圍時，應用于生物樣品分析時，檢測背景干擾?。?］；另外，利用具有特殊磁性的納米材料，可以實現復雜背景的分離工作等。

1.2用于蛋白質研究的熒光納米材料

1.2.1半導體量子點

量子點是主要由Ⅱ～Ⅵ族及Ⅲ～Ⅴ族元素構成的半導體納米顆粒。量子點在研究蛋白質方面具有許多優勢。首先，可以用同一激發波長的光源同時激發多種不同熒光的量子點，并且由于其發射譜帶窄而對稱，多種顏色的發射峰不易出現重疊與紅移拖尾，熒光光譜易于區分和識別［7］。另外，量子點的斯托克斯位移較大，可以有效避免激發峰與發射峰的重疊，減少干擾。此外，量子點的光學特征可以通過控制反應條件有效控制［8］。圖1即顯示了同一激發波長下的多色CdSe量子點。量子點熒光可調的光學特征為蛋白質多色標記及同步檢測奠定了基礎。近年來，金屬摻雜型量子點成為了人們廣泛研究的新課題。在量子點中摻雜微量金屬元素可以改變或者增加其發射中心的數量。其中，錳摻雜型量子點被研究最多，因為錳具有獨特的磁性能和光學性能從而能夠提供很好的摻雜系統［9］。金屬摻雜型量子點基本上保留了量子點的所有優點，另外，還可以避免由于斯托克斯位移引起的熒光自猝滅問題，熒光壽命更長［10］。

圖1　ZnS包被的CdSe量子點在近紫外燈下的10種不同顏色的發射光［11］11Fig.1Ten distinguishable emission colors of ZnS-capped CdSe QDs excited with a near-UV lamp［11］

1.2.2嵌入式核殼熒光納米顆粒

嵌入式核殼熒光納米顆粒是指一些負載有機熒光染料分子的無機納米顆?；蚨嗑凵锎蠓肿影恍图{米顆粒［12］。這種材料在蛋白質標記成像中有固有優點。首先，納米顆粒對內部所包裹的熒光染料有保護作用，使其熒光穩定性增強，可以克服外界環境對熒光材料的影響［13］。其次，一個納米顆粒內所包裹的熒光分子往往多達幾千甚至幾萬個，因此，更多的熒光分子可以連接在生物分子上，當產生信號響應時，很多熒光分子同時產生熒光信號，起到了信號放大的作用，從而提高檢測靈敏度［14］。但這種納米顆粒存在內部有機染料可能泄露的缺陷。在眾多嵌入式核殼熒光納米顆粒中，基于二氧化硅的納米顆粒由于其良好的生物修飾性、生物親和性和檢測靈敏度，近些年來發展迅速，并且逐漸擴展應用到生物分析的多個領域。

1.2.3碳點

碳點是一種近似球型且直徑小于10nm的零維半導體納米晶體，是由極少分子或是原子組成的納米團簇［15］。熒光性能是碳點最突出的性能，碳點具有熒光穩定性高、熒光波長可調、抗光漂白能力強、激發光寬且連續、能夠實現一元激發、多元發射等特點［16］。

制備碳點的碳源來源豐富且價廉、毒性低，常用的有蠟燭灰、天然氣燃燒產生的煙灰、活性炭、西瓜皮、檸檬酸等。利用碳點表面的—NH2和—OH，在碳點表面接上對生物分子有特異性識別作用的核酸適體或分子印跡聚合物，可提高分析的靈敏度和選擇性［17］。在蛋白質研究中，碳點通過與蛋白質的作用，改變了表面電子空穴對之間的復合效率，從而發生熒光的增強或猝滅，實現對蛋白質的標記和分析。

1.2.4碳納米管

碳納米管是由單層或多層類似六邊形網格結構的石墨烯片卷曲而成的中空納米管狀物。碳納米管的管徑通常為幾埃到幾十納米，長卻可以達到幾十微米到幾毫米。多壁碳納米管每層之間保持著固定的距離，約為0.34nm［18］。

O’Connell等［19］研究發現，單根分散的單壁碳納米管能夠在近紅外波段吸收光子并發出熒光。碳納米管發射的熒光是由于其表面存在較多缺陷，可以捕獲激發光的能量，屬于能帶間隙的光致發光。碳納米管的長度越短，發光強度越大，原因在于長度越短，缺陷越多，其最低空軌道和最高占有軌道之間的能隙增大，捕獲激發光的能量增強，因而發射的熒光也隨之增強［20］。但是由于碳納米管具有巨大的相對分子質量和很強的管間作用，容易團聚而導致熒光猝滅，且很難分散于水和其他溶劑中，這在一定程度上的限制了碳納米管的應用。因此，碳納米管的功能化修飾是目前碳納米管研究領域中的一個重要方向［21］。碳納米管在蛋白質研究領域的應用在國內并不常見，在國外主要集中在蛋白質標記成像方面。

1.2.5貴金屬元素納米簇

貴金屬元素納米簇的尺寸通常小于2nm，具有強的可見-近紅外熒光。同其他熒光納米材料相比，貴金屬元素納米簇更加穩定，分散性更好。近幾年來，貴金屬納米簇分子橋的研究是一大熱點。在過去的研究里，分子橋通常需要氨基或巰基進行連接，但是合成含有氨基或巰基的分子通常需要復雜的步驟。Komoto等［22］利用芳基碘化物作為金納米簇的連接分子，連接電極，構成分子橋，研究了其導電性質。由于金屬納米簇的低毒性，近紅外光譜特征，超小尺寸及優良的熒光性質，它們已廣泛用于蛋白質檢測、標記成像及蛋白質間相互作用的研究領域。

1.2.6磁性熒光納米顆粒

磁性熒光納米顆粒是一種結合了磁性和發光性能的納米材料。磁性熒光納米材料集合了磁性納米顆粒的快速磁響應性以及熒光材料的光致發光能力，在分離的同時還能進行光學檢測。陳順等［23］利用Fe3O4磁性納米粒子和量子點的結合，制備了具有熒光性質的磁性納米顆粒。采用表面活性劑修飾Fe3O4磁性納米粒子，經質子化后，Fe3O4磁性納米粒子表面披覆大量正電荷，與表面帶負電荷的核殼CdSe/CdS/ZnS量子點通過強烈的靜電作用發生組裝，得到兼具磁性和熒光性能的磁性熒光納米材料。Sathe等［24］將Fe3O4和量子點包覆在硅殼內，將合成的具有磁性的紅色量子點和沒有磁性的綠色量子點混合在一起，外加磁場并用蒸餾水沖洗，于熒光顯微鏡下觀察，沒有磁性的綠色量子點消失，視野中只剩下帶有磁性的紅色量子點?；谶@種方法可以設計蛋白質的快速分離。

從表1中可以看出，以上6種熒光納米材料的特點與特征、常見的表面功能修飾基團以及其可以再蛋白質研究方面的應用領域。

表1　各種熒光納米材料的特點、常見的表面功能修飾以及其在蛋白質研究方面的應用Table1Characteristics and functional surface modification of fluorescence nanomaterials，and their applications in protein research

2　熒光納米材料在蛋白質分析中的應用

2.1蛋白質標記成像

2.1.1熒光納米材料標記蛋白質的原理與條件

傳統染料分子在進行活體熒光成像時，會在體內循環而導致被測活體全身均有熒光，使得背景信號高，干擾作用強，靶向性差。而熒光特性良好的納米材料可以實現特異性地標記蛋白質。為了能與蛋白質相連，必須對納米材料的表面進行親水性修飾。以半導體納米晶體為例，目前主要采用兩種方法實現納米材料表面的功能化。一種是利用納米晶體表面的元素如Zn、Cd等與巰基之間強絡合作用，使半導體納米晶體與巰基酸絡合帶上羧基，實現親水功能化［25］。另一種是將半導體納米晶體的表面包覆一層親水層的無機物，然后在表面修飾可與生物材料連接的官能團，從而實現蛋白質的標記［26］。但對半導體納米晶體表面包覆一層物質，發光強度往往會下降，并且操作的難度較大。

2.1.2熒光納米材料在蛋白質標記成像方面的應用

由于納米材料生物相容性好、靶向性好、光學特性優良，在熒光成像中得到了廣泛應用。量子點最初用于生物領域便是標記簡單的生物大分子。2010年，Liu Jian等［27］利用多色量子點與CD15、CD30、CD45、Pax5這4種蛋白質生物標記物進行結合，根據蛋白質生物標記物與特定蛋白質的特異性相互作用，利用量子點—蛋白質生物標記物可以對B細胞、T細胞以及霍奇金淋巴瘤進行多色成像，實現了多色量子點對蛋白質的同步標記成像。2010年，Li Qin等［28］將碳點表面鈍化，與轉鐵蛋白進行標記，得到了轉鐵蛋白共軛的碳點。將蛋白質共軛和未共軛的碳點分別與HeLa細胞共同培養，發現前者標記的細胞熒光明顯增強，證明了轉運蛋白標記將有利于碳點通過細胞膜，增強其在細胞內的成像作用。與CdSe/ZnS量子點相比，碳點在成像中遷移速度較慢［29］。

Welsher等［30］利用碳納米管在近紅外區產生的熒光進行細胞成像。碳納米管與利妥昔單抗偶聯，通過抗體與細胞表面進行特異性識別進行成像。Xie Jianping等［31］于2008年合成了牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標記的近紅外金納米簇，這種被BSA包被的金納米簇結合體為貴金屬體內成像提供了可能。之后，Wu Xu等［32］用這種近紅外BSA-金納米簇結合體在裸鼠體內進行成像，發出紅色熒光。該熒光光穩定性良好，并且對小鼠沒有明顯毒性。碳納米管和金納米簇這兩種方法的突出優勢都是利用納米材料近紅外熒光，將材料熒光與背景熒光很好的區分開來，干擾較小。

2.2蛋白質相互作用的研究

2.2.1研究蛋白質相互作用的意義及技術方法

蛋白質間相互作用控制著生命的各個過程，是整個生命體結構和生命活動的基礎。目前，研究蛋白質相互作用的常規方法主要有化學交聯法、免疫共沉淀法、酵母雙雜交法和噬菌體展示法等。一些生物物理學方法也逐漸得到應用，有蛋白質熒光共振能量轉移技術、綠色熒光蛋白質近似成像技術和質譜等［33］。隨著納米技術的發展，熒光納米材料也逐漸應用到了蛋白質相互作用研究中。

2.2.2熒光納米材料在蛋白質相互作用方面的應用

在蛋白質相互作用的研究中，熒光共振能量轉移技術是一種常用的分析技術。熒光共振能量轉移是指運用熒光蛋白、傳統有機染料或其他新材料作為能量供體與能量受體，以適當頻率的光能照射供體，產生振蕩偶極子，與近處的受體探針的偶極子產生共振。這種共振作用會將供體熒光團的能量非放射性地轉移到受體熒光團。熒光共振能量轉移技術作為一種高效的光學“分子尺”，具有高分辨率、高靈敏度等優點。Wang Shaopeng等［34］在2002年利用量子點共振能量轉移原理，研究了BSA和抗BSA抗體（IgG）的特異性結合。分別用紅、綠兩種量子點標記BSA和IgG，根據BSA與IgG免疫相互作用，BSA和IgG形成免疫復合物。這種免疫復合物導致紅綠量子點之間發生共振能量轉移，BSA上的紅色量子點的熒光相對增強，IgG上的綠色量子點熒光相對減弱。當免疫復合物中加入BSA時，它就會與量子點-BSA競爭IgG上的結合位點，將量子點-BSA從免疫復合物上取代下來，阻止共振能量轉移的發生，熒光恢復。圖2顯示了熒光共振能量轉移導致了熒光變化情況。根據這種技術，可跟蹤了解抗原抗體免疫反應的情況。

圖2競爭性的BSA結合到免疫復合物形成的熒光共振能量轉移體系對熒光強度的影響［34］34Fig.2Effect of competitive BSA binding on fluorescence resonance energy transfer of the immunocomplex［34］

金納米簇也被報道用在蛋白質相互作用研究上。王麗霞［35］研究了確定濃度的金納米簇與胰蛋白酶的相互作用機理。金納米簇的出現使胰蛋白酶發生自發熒光猝滅，隨著金納米簇濃度的增加胰蛋白酶熒光猝滅增強，利用Stern-Volmer方程確定了猝滅常數以及猝滅機理，推測金納米簇與胰蛋白酶結合反應的猝滅機理很可能是復合物形成的靜態猝滅，而不是發生分子碰撞的動態猝滅，通過計算可以得到金納米簇-胰蛋白酶體系的結合常數和結合位點數。

2.3蛋白質固定與分離

功能化的磁性納米顆粒標記蛋白質時，一方面能夠作為載體起到富集與固定的作用；同時，磁性納米顆粒在外加磁場的作用下，能夠快速有效地實現免疫復合物與未結合物的分離。蛋白質與磁性納米粒子的結合和解離通過蛋白質與磁性納米粒子表面的電荷來控制，在低pH值條件（pH＜pI）下，帶正電的蛋白質被吸附在帶負電的磁性納米粒子表面；在較高的pH值（pH＞pI）下，帶負電荷的蛋白質將被排斥離開磁性納米粒子的表面［36］。Bucak等［37］報道了Fe3O4磁性納米粒子用于蛋白質混合物中單一蛋白質的回收和分離。該磁性納米粒子的吸附容量大，運用高梯度磁性過濾技術，不受其他共存物質的干擾，沒有常用離子交換劑的傳輸阻力，很容易進行蛋白質回收。另外，基于磁性熒光雙功能納米材料在此領域也逐步得到了應用，在實現蛋白質固定的同時可對多種物質進行可視分析檢測。王顯祥等［38］用CdTe量子點和超順磁性納米Fe3O4合成了熒光和磁性雙功能親水復合納米材料，并在這種復合納米材料表面固定了葡萄糖氧化酶。基于葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產生H2O2能夠引起量子點熒光的猝滅，實現了對樣品中葡萄糖的分離和快速可視化熒光檢測。

2.4快速超靈敏蛋白質分析檢測

2.4.1基于熒光納米材料自身與蛋白質的相互作用進行檢測

蛋白質的痕量分析檢測在食品、藥物及臨床分析中具有重要意義。基于熒光納米材料與蛋白質的相互作用，利用納米材料的特殊熒光性質，實現對蛋白質的精確、快速痕量分析。Cai Zhaoxia等［39-40］基于共振瑞利散射的原理，利用金納米粒子和摻雜Cd的ZnSe量子點為探針實現了雞蛋白中溶菌酶的超靈敏分析，檢測限可達納克級別。圖3是Cd摻雜ZnSe量子點和溶菌酶作用體系的共振瑞利散射光譜圖。當量子點與溶菌酶結合后，由于共振瑞利散射作用，散射強度顯著增強，該方法靈敏度高，檢測速度快。

圖3Cd摻雜的ZnSe量子點和溶菌酶作用系統的RRS光譜RRS［40］40Fig.3RRS spectra of Cd doped ZnSe QDs and lysozyme systems［40］

2.4.2基于熒光共振能量轉移技術進行檢測

基于熒光共振能量轉移技術，也可以進行蛋白質的分析檢測。由于熒光共振能量轉移技術具有光學“分子尺”的作用，故在蛋白質分析檢測中具有更高的靈敏度。黃珊等［41］使用CdSe量子點，基于量子點與蛋白質之間的能量轉移，建立了簡單快速檢測溶菌酶的新方法。該法在0.01～0.8μmol/L的范圍內，熒光強度與溶菌酶濃度呈很好的線性關系，檢測限為5.2nmol/L。

2.4.3基于特異性免疫反應進行檢測

基于抗原抗體間的免疫反應，可以實現特定蛋白質的定量檢測。Xu Bailu等［42］在2012年以葡萄糖為碳源制備出可溶于水的碳點，再分別用氨基修飾的凝血酶適體TBA15和TBA29修飾該碳點和SiO2納米顆粒，凝血酶便可與這兩者相互作用形成“碳點-凝血酶-SiO2納米顆粒”夾層結構，隨著凝血酶濃度的增加，碳量子點的熒光強度增加，檢測限為1nmol/L。林卉［43］提出了根據金納米簇熒光猝滅機理，檢測無標記木瓜蛋白酶檢測方法。木瓜蛋白酶對包覆在BSA-金納米簇表面的BSA的降解可引起BSA-金納米簇的聚集，進而使BSA-金納米簇的熒光發生猝滅。熒光強度的變化對木瓜蛋白酶的濃度有很好的響應，對木瓜蛋白酶的檢測限為0.07μg/mL。Ruan Xiaojuan等［44］通過ZnSe量子點，根據對牛分支桿菌表面的MPB83蛋白與其抗體之間的特異性免疫反應，實現對MPB83蛋白的痕量分析，為牛分支桿菌的快速檢測提供了一種新思路。目前，基于免疫層析技術的量子點試紙條在醫學檢測方面的研究取得較大進展。郭勤［45］利用CdTe量子點偶聯入葡萄球菌蛋白A，在免疫量子點的基礎上，構建了免疫層析試紙條檢測抗HIV-1gp41抗體，為熒光納米材料的商品化、便攜化應用奠定了基礎。這些方法通過免疫相互作用進行蛋白質測定，其特異性良好，干擾較小，可以方便快捷實現高通量的分析檢測。

3　結語

隨著科學技術的不斷發展，蛋白質研究技術也在不斷地發展、進步和完善。熒光納米材料作為近些年來極具發展潛力的新型材料，以其特殊的光學性質在蛋白質應用研究中顯示出獨特的優越性?；诙喾N新型的熒光納米材料的熒光特性，可用于蛋白質快速分析檢測、蛋白質相互作用、蛋白質標記成像等多個方面。磁性熒光納米顆?，F已有成熟的合成方法，但在蛋白質研究方面應用還不夠廣泛，基于其良好的熒光性與磁性，未來應用前景也將十分廣闊?？傊瑹晒饧{米材料由于其特殊的光學和電學性質，將會在蛋白質領域有著更廣泛的應用價值和發展前景，將會應用于蛋白質的各個領域并帶來革命性的進步。

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Recent Progress in Fluorescence Nanomaterial Application in the Field of Protein Analysis

WANG Qi，WANG Beibei，MA Meihu，CAI Zhaoxia*
（National Research and Development Center for Egg Processing，College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China）

Protein plays an important role in human metabol ism，immunity and disease occurrence.At present，proteins have been studied in the fields of biology，medicine，food and others.The technologies used for protein research have become the focus of worldwide attention.Developing functional fluorescent nano-materials with good optical properties and biocompatibility is of great significance for the labeling，analysis and separation of protein.In this paper，the basic properties of fluorescent nano-materials are outlined，such as semiconductor quantum dots，embedded core-shell nanoparticles，carbon dots，carbon nanotubes，precious metal element nano-clusters，and fluorescent magnetic nanoparticles.We also review the applications of these kinds of nano-materials in protein marker imaging，protein interaction，protein immobilization and separation，and protein detection.

fluorescence；nanometer materials；protein；application

O65

A

1002-6630（2015）05-0221-06

10.7506/spkx1002-6630-201505041

2014-05-22

國家自然科學基金面上項目（31371810）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（2013PY036）

王琪（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：401384873@qq.com

蔡朝霞（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與分析。E-mail：caizhaoxia@mail.hzau.edu.cn