聚酰胺純化刺頭復葉耳蕨總黃酮的研究

李輝敏

（九江學院基礎醫學院，江西 九江 332000）

聚酰胺純化刺頭復葉耳蕨總黃酮的研究

李輝敏

（九江學院基礎醫學院，江西 九江 332000）

目的 研究聚酰胺樹脂純化刺頭復葉耳蕨總黃酮的工藝條件。方法 以總黃酮的吸附率、純化率為評價指標，考察聚酰胺樹脂對刺頭復葉耳蕨總黃酮的吸附和洗脫條件。結果 所得最佳純化工藝：上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質量濃度調節為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h。結論聚酰胺樹脂能有效富集、純化刺頭復葉耳蕨總黃酮。關鍵詞：刺頭復葉耳蕨；總黃酮；聚酰胺樹脂；純化工藝

刺頭復葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）為鱗毛蕨科復葉耳蕨屬植物，廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶濕潤區域，在我國主要分布于長江流域以南地區，具有清熱利濕、抗菌消炎等作用，民間用于治療急性黃疸型肝炎、痢疾、燙火傷等，其主要化學成分為黃酮類化合物［1］。有研究表明鱗毛蕨類植物有包括抗病毒、抗腫瘤等藥理作用，產生這些藥理作用的成分為黃酮類化合物［2］。本研究經過預實驗摸索，在參考文獻的基礎上［3，4］，選擇60-90目的聚酰胺來純化刺頭復葉耳蕨總黃酮，建立純化工藝，為刺頭復葉耳蕨總黃酮的開發研究提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺頭復葉耳蕨采自江西省星子縣，經九江學院高春華教授鑒定為鱗毛蕨科（Dryopteridaceae）復葉耳蕨屬（Arachniodes）刺頭復葉耳蕨（Arachniodes exilis Ching）的根莖。對照品：蘆丁（中國生物制品檢定所，批號100080-200306）；Al（NO3）3，上海科思精密化學品公司；60-90目聚酰胺，河北滄州化工有限公司；其他所有試劑（均為分析純），汕頭市西隴化工有限公司。

1.2 儀器

電子分析天平（BT224S型），德國賽多利斯；紫外可見分光光度計（TU-1901），北京普析通用儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀（RE-52AA），上海亞榮生化儀器廠；真空干燥箱，上海精密儀器有限公司。

2 方法

2.1 總黃酮含量測定

利用紫外-可見分光光度法，以蘆丁為標準品，采用Al（NO3）3顯色法，在486.4 nm波長下測定標準曲線［5］，得到線性回歸方程：Y=0.0121X-0.0322，R2=0.9998，線性關系在17.20～ 68.80 μg/ml范圍內。根據標準曲線法測定各樣品中總黃酮的含量。

2.2 刺頭復葉耳蕨總提取物溶液的制備

取一定量刺頭復葉耳蕨根莖粉末以60%乙醇，固液比1∶20，超聲提取3次，每次超聲提取時間為30 min。將所得提取液經過濾后減壓濃縮至一定濃度，冷凍干燥得復葉耳蕨總提取物干燥粉末，測定該固體粉末中總黃酮含量為46.45%。取200 mg復葉耳蕨總提取物凍干粉用蒸餾水定溶于100 ml容量瓶，超聲溶解，搖勻即得供試品溶液。

2.3 聚酰胺預處理

取60-90目的聚酰胺用95%乙醇浸泡24 h，用乙醇沖洗至洗出液加蒸餾水無白色渾濁，再用大量的蒸餾水洗至無醇味。

2.4 聚酰胺純化條件的選擇

2.4.1 上樣液pH值選擇 取供試品溶液10 ml各5份，分別滴加稀鹽酸或稀氫氧化鈉溶液調pH值為3、4、5、6、7。另外分別取2.0 g已預處理好的60-90目聚酰胺樹脂5份，濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，控制流速為2.0 BV/h進行動態吸附，用蒸餾水洗至Molish反應呈陰性，再用70%乙醇進行洗脫至洗脫終點，收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，測定吸光度，計算聚酰胺樹脂的吸附率。

2.4.2 上樣液濃度選擇 分別取2.0 g已預處理好的60-90目聚酰胺樹脂3份，濕法裝柱，精密吸取不同質量濃度的刺頭復葉耳蕨總提取物溶液各10 ml，控制流速為2.0 BV/h進行動態吸附，用蒸餾水洗至Molish反應呈陰性，再用70%乙醇進行洗脫至洗脫終點，收集洗脫液，減壓濃縮至20 ml，測定吸光度，計算聚酰胺樹脂的吸附率。

2.4.3 洗脫溶劑選擇 分別取2.0 g已預處理好的60-90目聚酰胺樹脂5份，濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，控制流速為2.0 BV/h，用蒸餾水沖洗至清洗液的Molish反應無現象，再分別用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，測定吸光度，優化篩選洗脫溶劑。

2.4.4 泄露曲線考察 取2.0 g已預處理好的60-90目聚酰胺樹脂，濕法裝柱，加入100 ml供試品溶液，取蒸餾水進行沖洗，直至清洗液的Molish反應無現象。在流速為2.0 BV/h的條件下，取70%乙醇對樹脂中所吸附的刺頭復葉耳蕨總黃酮進行解吸附，收集洗脫液，以每10 ml為一個流份，減壓濃縮成浸膏后定容于100 ml容量瓶中，分別依法測定吸光度，以累計總體積為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制泄露曲線，確定最佳上樣量。

2.4.5 洗脫流速選擇 取2.0 g已預處理好的60-90目聚酰胺樹脂3份濕法裝柱，取10 ml供試品溶液上樣，取蒸餾水進行沖洗，直至清洗液的Molish反應無現象。分別控制流速為1.0、2.0、3.0 BV/h，取70%乙醇對樹脂中所吸附的刺頭復葉耳蕨總黃酮進行解吸附。收集洗脫液，減壓濃縮至20 ml，測定其黃酮含量，計算解吸附率。

2.4.6 驗證試驗 取樣品溶液3份，按以上所得最佳條件進行分離純化，測定計算所得黃酮洗脫率，并計算RSD值。

3 結果

3.1 上樣液pH值選擇

結果見圖1，上樣液pH值變化可影響聚酰胺樹脂的吸附率。當pH=5.0時聚酰胺樹脂的吸附率最大。當溶液pH值高于樣品溶液中黃酮類成分的pKa值時，樣品易以鹽的形式而不以游離狀態存在，不利于吸附；而當溶液pH值低于4時，吸附率較低，這可能是由于黃酮類成分在酸性過強的條件下轉變為佯鹽，不利于吸附。當pH=5.0時，樣品溶液中黃酮類化合物保持分子狀態，以游離形式存在，易被吸附，故此pH條件下吸附量最大。

圖1 上樣液pH值對聚酰胺樹脂吸附率的影響

3.2 上樣液濃度選擇

結果見圖2，聚酰胺樹脂對樣品溶液中黃酮的吸附率隨著上樣溶液濃度的增加而有所降低，提示樣品溶液中黃酮質量濃度較低時易于吸附與解吸附，同時考慮上樣體積增加對生產效率有一定降低作用。本研究最終選擇將樣品溶液黃酮質量濃度調節為2.0 mg/ml后進行純化。

圖2 上樣液濃度對吸附率的影響

3.3 洗脫溶劑選擇

結果見圖3，乙醇濃度低于70%時，對聚酰胺樹脂柱上黃酮的洗脫作用較弱，而當乙醇濃度高于70%時，對黃酮的洗脫作用增加不明顯，從節省溶劑等方面考慮，最終選擇以70%乙醇作為聚酰胺樹脂純化條件下的洗脫溶劑。

圖3 不同洗脫溶劑對聚酰胺樹脂解吸附率的影響

3.4 泄露曲線考察

結果見圖4，當上樣量過載時，黃酮發生泄漏，隨清洗液流出，當用蒸餾水清洗到第8個流份時，所得累計流份中黃酮含量幾乎不再發生變化，證明此時過載的黃酮已隨清洗液全部流出。計算清洗液中黃酮含量，可知2 g聚酰胺樹脂對黃酮的飽和吸附量為79 mg，所以要求每克聚酰胺樹脂總黃酮上樣量不能超過39 mg。

圖4 泄露曲線

3.5 洗脫流速選擇

結果見圖5，洗脫流速分別為1.0、2.0、3.0 BV/h時，吸附率相應有一定程度的下降。當洗脫流速為1.0 BV/h時，吸附與解吸作用最好。同時考慮到洗脫時間的控制，生產效率的提高，本研究最終選擇2.0 BV/h作為洗脫流速。

圖5 流速對吸附率的影響

3.6 純化工藝驗證

精密稱取已經預處理的聚酰胺樹脂2 g各3份，濕法裝柱；按上述實驗所得到的最佳純化工藝條件（即上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質量濃度調節為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h）進行驗證實驗，平行3次，收集洗脫液，減壓濃縮后按標準溶液配制方法顯色得到待測溶液，測定吸光度，計算總黃酮的洗脫率，結果顯示：平均洗脫率為79.50%，RSD為3.98%，表明該純化工藝穩定可行（見表1）。該純化后的溶液經減壓濃縮冷凍干燥后得到的干燥粉末中黃酮含量為71.64%，比純化前提高了25.19%。

表1 刺頭復葉耳蕨總黃酮純化工藝驗證結果（%）

4 結論

本研究建立了以聚酰胺樹脂純化的方法獲得刺頭復葉耳蕨總黃酮，得出其最佳純化工藝條件：上樣液pH值為5，上樣溶液黃酮質量濃度調節為2.0 mg/ml，以70%乙醇為洗脫劑，洗脫流速為2.0 BV/h，洗脫率可達到79.50%。該條件下所得洗脫液經減壓回收溶劑，冷凍干燥后得到黃酮含量為71.64%的刺頭復葉耳蕨總黃酮凍干粉。聚酰胺樹脂純化條件的建立為刺頭復葉耳蕨中黃酮成分的純化提供了依據，從而為進一步研究刺頭復葉耳蕨中黃酮成分的藥理活性提供基礎。

［1］周道年，阮金蘭，蔡亞玲.復葉耳蕨地上部分黃酮類化合物［J］.中國藥學雜志，2008，43（16）：1218-1220.

［2］李輝敏.復葉耳蕨屬植物研究進展［J］.九江醫學，2009（3）：91-93.

［3］胡軍萍，依再提古麗·司馬義，楊建華.酒花黃酮的純化工藝［J］.食品科學，2013，34（12）：40-44.

［4］吳新榮，劉志剛，顏仁梁，等.聚酰胺顆粒分離純化土茯苓總黃酮研究［J］.中藥材，2009，32（10）：1606-1609.

［5］張玉祥，邱蔚芬，銀杏葉超聲波提取工藝研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17 （5）：784-785.

R285.5

A

1671-1246（2015）09-0104-03

注：本文系江西省教育廳資助項目（GJJ12737）；江西省衛生廳資助項目（2012A014）