常見果蔬VC含量測定方法篩選研究

王源秀等

摘 要：在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)本科教學(xué)實(shí)踐中，分別應(yīng)用2，6-二氯酚靛酚滴定法、磷鉬酸法和紫外分光度計(jì)法測定果蔬中的VC含量，從試劑配制、實(shí)驗(yàn)操作過程以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果幾個(gè)方面對這3種方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，紫外分光光度法測定果蔬VC含量最為簡便、精確，可作為《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)中“常見果蔬VC含量測定”實(shí)驗(yàn)的操作方法。

關(guān)鍵詞：VC；測定；二氯酚靛酚滴定法；磷鉬酸法；紫外分光度計(jì)法

中圖分類號 TS255 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-20-04

Exploration of the Methods by Quantitative Determination of VC in Common Fruits and Vegetables

Wang Yuanxiu et al.

（College of Life Science，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Abstract：In the undergraduate teaching of “Biochemistry Experiment”，students tried to determine the content of VC in different kinds of fruits and vegetables using threemethods（themethod by 2，6-dichloro-indophenol titration，themethod by phosphomolybdic acid and themethod by UV spectrophotometer）.We compared threemethods roundly from the reagent preparation，experimental operation process and the experimental results.We ensured that themethod by UV spectrophotometer was themost simple and the students could get themost accurate results using it，so we choose it as the operationmethod in the teaching of “the determination of the content of VC in common fruits and vegetables " in “Biochemistry Experiment "

Key words：Vitamin C；Determination；Themethod by 2，6-dichloro-indophenol titration；Themethod by phosphomolybdic acid；Themethod by ultraviolet spectrophotometermethod

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是本科生物類專業(yè)學(xué)生的必修課程，“VC的定量測定”是其中的備選經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，以往多采用2，6-二氯靛酚滴定法[1]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)；該方法雖操作簡單，儀器及試劑廉價(jià)，但學(xué)生操作過程中易出現(xiàn)滴定管滲漏現(xiàn)象，且在使用含有色素試材時(shí)，會(huì)導(dǎo)致滴定終點(diǎn)難以判定，結(jié)果不精確。因此該方法已不適合現(xiàn)代生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要。

“VC的定量測定”除2，6-二氯靛酚滴定法方法之外，目前使用較多的主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法、鉬藍(lán)比色法、原子吸收法、碘量法、電位滴定法、熒光光度法[2-10]。其中原子吸收法、高效液相色譜法和熒光光度法儀器相對昂貴；碘量法和電位滴定法操作步驟較繁瑣，且受其它還原性物質(zhì)、樣品色素顏色和測定時(shí)間的影響，不適合作為本科生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

為了培養(yǎng)創(chuàng)新型人才，生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要引入“研究性”實(shí)驗(yàn)，對“VC的定量測定”實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，如可改為“常見果蔬VC含量測定”[11]。由于《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》是專業(yè)基礎(chǔ)課，每個(gè)實(shí)驗(yàn)需供300以上的學(xué)生來做，這就需要實(shí)驗(yàn)方法簡單易行，試劑試材廉價(jià)，并且能獲得較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為此，筆者對3種實(shí)驗(yàn)室常用的測定VC含量的方法，即二氯酚靛酚滴定法、磷鉬酸法和紫外分光度計(jì)法，進(jìn)行了對比試驗(yàn)，以期能找到適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的易于操作的定量測定VC的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮的番茄、橘子、青椒、棗子、蘋果，購買于蕪湖市銀湖南路沃爾瑪超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外-可見分光光度計(jì)（WJ 7200型，上海尤尼克儀器有限公司）、酸式5mL微量滴定管、磁力攪拌器（79HW型，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、打漿機(jī)（MJ-BL25C3，廣東美的生活電器制造有限公司）、離心機(jī)（KDC-40型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、研缽、容量瓶。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 草酸、2，6-二氯酚靛酚、抗壞血酸（VC）、鉬酸銨、EDTA、硫酸、乙酸、偏磷酸、HCl、NaOH，均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

二氯酚靛酚滴定法和磷鉬酸法的具體實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)器材、試劑、操作步驟和數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)1。紫外分光光度法的具體實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)器材、試劑、操作步驟和數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)2。樣品測定時(shí)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 二氯酚靛酚滴定法 由圖1可知，采用二氯酚靛酚滴定法獲得的5種果蔬VC的含量分別為：蘋果0.69mg/100g，番茄3.20mg/100g，橘子10.95mg/100g，青椒28.83mg/100g，棗子131.65mg/100g，其中棗子的VC含量最高，蘋果的VC含量最低。

利用二氯酚靛酚滴定法測定果蔬的VC含量，使用的試劑種類少（需3種），步驟簡單，只有操作酸式微量滴定管時(shí)略微復(fù)雜，適合本科生操作。但學(xué)生在操作滴定管時(shí)，時(shí)常更換操作人，且部分學(xué)生對滴定管操作陌生，會(huì)導(dǎo)致滴定管滲漏；二氯酚靛酚滴定時(shí)，滴定終點(diǎn)為微粉紅色，而某些果蔬（如橘子、西紅柿）色澤鮮亮，呈偏紅色，對滴定終點(diǎn)的判斷影響顯著，要想得到準(zhǔn)確的結(jié)果，需要采用反滴定法[8]，使操作變復(fù)雜；另外2，6-二氯酚靛酚試劑價(jià)格昂貴。

3.2 磷鉬酸法 采用磷鉬酸法定量測定VC，其原理是鉬酸銨在一定條件下（硫酸和偏磷酸根離子存在）與VC反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)，吸光度與濃度成正比。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，該藍(lán)色化合物在760nm處有最大吸收峰。由圖2可知，VC濃度與760nm處的吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.0018x+0.0078，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9933。

由圖3可知，通過磷鉬酸法測得果蔬中VC含量，分別為：蘋果0.79mg/100g，番茄5.55mg/100g，橘子10.32mg/100g，青椒42.29mg/100g，棗子111.52mg/100g，5種果蔬中VC含量的多少順序與用二氯酚靛酚滴定法測得到結(jié)果一致，即棗子>青椒>橘子>蘋果>番茄。

在用磷鉬酸法測定果蔬的VC含量，步驟簡單，但所需試劑種類較多（需7種，見實(shí)驗(yàn)方法），且需學(xué)生提前學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)操作分光光度計(jì)；在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，所有試劑（標(biāo)準(zhǔn)VC溶液、草酸-EDTA、偏磷酸-乙酸、硫酸、鉬酸銨）按比例混合后，混合液在30℃水浴時(shí)易變渾濁，形成黃色沉淀，如果操作不熟練，時(shí)間略長后，黃色沉淀會(huì)附著在分光光度計(jì)的比色皿上，難以清洗。

3.3 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用VC對紫外產(chǎn)生吸收和對堿不穩(wěn)定的特性，于243nm處測定樣品液與堿處理樣品液兩者吸光度之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計(jì)算樣品中VC的含量。由圖4可知，紫外分光光度法中，VC的含量在1.0～12.0μg/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與紫外吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=1.8275x-0.0042，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

由圖5可知，通過紫外分光光度法測得果蔬中VC的含量分別為：蘋果10.00mg/100g，番茄12.50mg/100g，橘子17.50mg/100g，青椒114.78mg/100g，棗子150.00mg/100g。該方法測得的各種果蔬的VC含量比前2種方法測得的VC含量存在顯著差異，即該方法測得的各種果蔬的VC含量比較高，其中差異最小的是棗子，但也高出14%（與二氯酚靛酚法相比）。

利用紫外分光光度法測定果蔬的VC含量，所使用的試劑種類少（需3種）且廉價(jià)，步驟簡單易行，適合本科生操作。但需學(xué)生提前學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)操作紫外分光光度計(jì)；而且紫外光敏感，需準(zhǔn)確調(diào)試；另外紫外分光光度計(jì)略昂貴。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論 3種方法測得5種果蔬中VC含量的大小順序均為：棗子>青椒>橘子>蘋果>番茄。以《中國食物成分表2012》為參考，由圖6可知，紫外分光光度法測得果蔬中VC含量與參考數(shù)據(jù)最接近，由二氯酚靛酚滴定法測得水果中VC含量與參考數(shù)據(jù)偏差較大[12]。

4.2 討論 將3種方法的各具體操作事項(xiàng)進(jìn)行比較，如表1所示。二氯酚靛酚滴定法的所用試劑VC、草酸和2，6-二氯酚靛酚，這些試劑配制簡單，但2，6-二氯酚靛酚溶液不穩(wěn)定，需在棕色瓶中冷藏，且只能用7d；試劑標(biāo)定復(fù)雜；使用滴定管不當(dāng)，易滲漏，滴定終點(diǎn)不易判斷，易受試材色素影響，而整個(gè)操作過程要迅速，防止還原型VC被氧化；滴定過程一般不超過2min，如果時(shí)間沒有把握好，則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。總的來說，該法產(chǎn)生誤差的因素多，不易測得精確數(shù)據(jù)。磷鉬酸法所用試劑繁多（7種），且不易配制。對于實(shí)驗(yàn)操作熟練者，該法操作過程簡便，能得到較精確的標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但對于不熟練者，實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長，就會(huì)出現(xiàn)黃色沉淀，影響操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。紫外分光光度法所用試劑種類少（標(biāo)準(zhǔn)VC、草酸和NaOH），且價(jià)格低廉，易配制。該法操作步驟簡便，但是實(shí)驗(yàn)過程中需要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和正確使用紫外分光光度計(jì)。對于操作者，只有認(rèn)真仔細(xì)，基本可測得較精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，紫外分光光度法可選為“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”教學(xué)的操作方法，用于測定不同果蔬VC含量，過實(shí)踐教學(xué)試用也證實(shí)該法切實(shí)可行[11]。在具體實(shí)踐教學(xué)中，“常見果蔬VC含量測定”屬于“綜合研究性”實(shí)驗(yàn)，每小班學(xué)生（約20人，分10個(gè)小組）需根據(jù)命題事先寫好研究方案，方案通過后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。操作時(shí)每小組測定1種果蔬的VC含量，這樣每個(gè)小班就可以獲得約10種果蔬的VC含量數(shù)據(jù)，每個(gè)小組收集這10種果蔬的VC含量數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，撰寫研究小論文。通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以提高實(shí)驗(yàn)操作技能，學(xué)會(huì)數(shù)據(jù)處理和論文寫作的基本方式方法。

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