消痰散結方對MKN—45人胃癌裸鼠原位移植瘤細胞超微結構的影響

葉敏等

摘要：目的 觀察消痰散結方對MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤細胞超微結構的影響，探討其治療胃癌的作用機制。方法 采用MKN-45人胃癌細胞株建立裸鼠皮下瘤模型皮下傳3代作為實驗模型的瘤源，采用0B膠黏合法建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。40只模型裸鼠分為空白對照組、模型組、消痰散結方組、替加氟組，每組10只。消痰散結方組給予消痰散結方灌胃，替加氟組給予替加氟灌胃，模型組給予生理鹽水灌胃，空白對照組正常飲食喂養。干預6周后，測瘤質量，計算抑瘤率。透射電鏡觀察藥物作用后移植瘤細胞超微結構。結果 消痰散結方組瘤質量明顯低于空白對照組及模型組（P<0.05，P<0.01），其抑瘤率為46.2%；電鏡觀察可見胃癌細胞出現典型細胞凋亡的形態學改變。結論 消痰散結方具有誘導MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤細胞凋亡的作用，提示誘導細胞凋亡是消痰散結方治療胃癌的可能作用機制之一。

關鍵詞：消痰散結方；胃癌；細胞超微結構；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.017

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0060-03

Effects of Xiaotan Sanjie Decoction on Ultramicrostructure in MKN-45 Human Gastric Cancer Orthotopic Xenograft YE Min， SUN Da-zhi， XIU Li-juan， LU Ye， Instructor：WEI Pin-kang （Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Changzheng Hospital， Second Military Medical University of PLA， Shanghai 200003， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Xiaotan Sanjie Decoction on ultramicrostructure in MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenograft；To discuss its mechanism for gastric cancer. Methods MKN-45 human gastric cancer cell line was used to establish subcutaneous tumor model in nude mice as an experimental model which passed three generations of tumor source. Then OB glue was used to establish human gastric cancer orthotopic xenograft model. 40 model nude mice were divided into control group， model group （received gavage with saline）， Xiaotan Sanjie Decoction group （received garage with Xiaotan Sanjie Decoction） and Tegafur group （received gavage with Tegafur）， 10 mice in each group. Mice in the control group were under normal diet， without medicine intervention. After 6 weeks of treatment intervention， tumor weight was detected， inhibitory rate was calculated， the ultrastructural changes of gastric cancer cells were detected through transmission electron microscopy. Results The tumor weight in Xiaotan Sanjie Decoction group was significantly lower than that in control group and model group （P<0.05，P<0.01）. The tumor inhibition rate was 46.2%. Under the electron microscope， MKN-45 gastric cancer cells strain changed to typical apoptosis. Conclusion Xiaotan Sanjie Decoction can lead to apoptosis effects on MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenografts. All evidences indicate that inducing apoptosis may be one of the most important mechanisms of Xiaotan Sanjie Decoction in treating gastric cancer.

Key words：Xiaotan Sanjie Decoction；gastric cancer；cell ultrastructure；mice

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81273910）

通訊作者：孫大志，E-mail：sunda-zhi@163.com

消痰散結方為我科魏品康教授臨證40余年經驗方，臨床治療胃癌療效較好[1]。前期實驗研究顯示，消痰散結方可抑制MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的微衛星不穩定、在體外對結直腸癌HCT116細胞有抑制增殖、促進凋亡的作用[2-3]。本實驗選取MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤腫瘤細胞，通過透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結構，進一步明確消痰散結方對胃癌干預的機理。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性裸鼠40只，7周齡，體質量18～20 g，上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SYXK（滬） 2012-0002。實驗動物飼養于中國科學院上海實驗動物中心動物房的空氣層流架內，飼養條件為SPF級。

1.2 細胞株

MKN-45人胃癌細胞株，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.3 藥物

消痰散結方由法半夏、制天南星、全蝎、蜈蚣、茯苓、雞內金、炙甘草等藥物組成，飲片購自上海雷允上公司，消痰散結方原液（含原藥材約3.35 g/mL）由本院藥材科制劑中心制備；替加氟片，齊魯制藥有限公司，批號206003LD，將其研磨成粉末，溶于生理鹽水，濃度為7.8 mg/mL。

1.4 主要試劑與儀器

多聚甲醛，美國Sigma公司；鋨酸，美國TED PELLA公司。H-7650型透射電鏡，日立（中國）有限公司；UC6型超薄切片機，德國Leica儀器有限公司。

1.5 造模

1.5.1 裸鼠皮下瘤模型建立 0.2 mL MKN-45人胃癌細胞懸液接種于1只裸鼠右側近腋部皮下，當皮下移植瘤直徑長至約1 cm時剝取移植瘤，切成1 mm3瘤塊，再經套管針轉種至另1只裸鼠腋部皮下，如此反復進行鼠間傳代，以第3代皮下移植瘤為實驗模型的瘤源[4]。

1.5.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立 從裸鼠腋下剝取腫瘤組織，剪成1 mm3瘤塊備用。實驗裸鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛0.03 mL/10 g麻醉，常規手術，在胃大彎近胃竇處用1 mL無菌空針頭劃破胃壁漿膜層，用無齒鑷將破損處向內推壓，使局部胃壁形成凹龕，植入一塊瘤組織于凹龕內，并在瘤塊表面滴OB膠1滴，40 s凝固后將胃壁回納入腹腔，0號絲線縫合腹膜及皮膚，關腹，復蘇。40只荷瘤鼠均復制成功并存活。造模成功后48 h開始給藥干預6周。

1.6 分組及給藥

選擇MKN-45人胃癌原位移植瘤裸鼠40只，隨機分為空白對照組、模型組、消痰散結方組、替加氟組，每組10只。替加氟組予替加氟溶液灌胃，消痰散結方組予消痰散結方灌胃，均相當于臨床人服用劑量10倍，模型組予等量生理鹽水灌胃，灌胃體積0.4 mL/d。空白對照組正常飲食喂養。連續6周。

1.7 觀察指標

1.7.1 瘤重及抑瘤率 各組灌胃結束麻醉脫頸處死裸鼠，分離腫瘤，稱取瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（各組平均瘤質量-模型組平均瘤質量）÷模型組平均瘤質量×100%。

1.7.2 移植瘤細胞超微結構 把少量預冷的4%多聚甲醛滴在卡片紙上。用刀片取下一小片瘤組織，用滴管吸取等滲0.9%氯化鈉溶液，把血液和組織液沖掉，立即放入卡片紙上的4%多聚甲醛小滴中，然后用新的干凈雙面刀片把瘤組織切成1 mm?小塊，放入裝有4%多聚甲醛的小管中浸泡固定。小管置于4 ℃冰箱中保存。脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射電鏡觀察。

1.8 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示。采用Levene檢驗進行方差齊性檢驗，數據資料均方差齊，采用完全隨機的方差分析，多個均數的比較用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 消痰散結方對瘤重及抑瘤率的影響

稱取瘤重，經方差分析，所有實驗組差異有統計學意義（P=0.00）。進一步兩兩比較，空白對照組與模型組、消痰散結方組與替加氟組差異無統計學意義（P>0.05）；消痰散結方組、替加氟組分別與空白對照組、模型組比較，瘤質量明顯降低（P<0.05，P<0.05）；消痰散結方組抑瘤率為46.2%，替加氟組抑瘤率為47.3%。結果見表1。

2.2 透射電鏡觀察結果

空白對照組及模型組腫瘤細胞膜完整，細胞核、線粒體、內質網形態基本正常；消痰散結方組腫瘤細胞細胞膜不連貫，細胞核出現固縮，染色體異染色質聚集，線粒體結構破壞，嵴結構消失，內質網擴張，胞質中出現大量空泡，細胞呈凋亡狀態；替加氟組細胞胞質內出現巨大空泡，細胞核固縮，線粒體結構消失，內質網擴張，呈凋亡狀態。結果見圖1。

3 討論

胃癌屬中醫“噎膈”“反胃”“積聚”等病證范疇。魏品康教授總結臨證40余年經驗，認為胃癌發病機制為六淫入侵、飲食失宜及七情內傷，導致氣機阻滯，津液停滯，痰濁內蘊，浸淫細胞，細胞突變，進而結聚為腫瘤。基于對胃癌病因病機“痰本質”的認識，魏品康教授提出胃癌治療的“消痰散結”法。

消痰散結方由二陳湯合導痰湯化裁而來，方以法半夏、制南星辛溫苦燥、善消痰燥濕共為君，天龍、全蝎等解毒散結通絡共為臣，陳皮理氣和胃、雞內金助胃之消導而為佐，炙甘草溫中健脾、調和諸藥為使。本方在消痰藥物中輔以理氣散結之品，使頑痰得以消散，病因得以根除。

本實驗選用替加氟作為陽性藥物，替加氟是氟尿嘧啶的衍生物，先在體內經肝臟活化逐漸轉變為氟尿嘧啶，再轉變為氟尿嘧啶核苷和脫氧氟尿嘧啶核苷，然后才發揮其強有力的對胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制作用，從而發揮其抗腫瘤活性，在體內干擾、阻斷DNA、RNA及蛋白質合成，是一種抗嘧啶類藥物。目前臨床以5-氟尿嘧啶（5-Fu）為基礎的聯合化療作為一線治療方案，及以替加氟為基礎的聯合化療方案，均被證實對胃癌的臨床療效明確[5-6]。并且體外實驗研究顯示，MKN-45胃癌細胞對5-Fu高度敏感[7]。

本研究發現，消痰散結方對MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤有明顯的抑制作用，消痰散結方組瘤質量明顯低于空白對照組及模型組（P<0.05），其抑瘤率為46.2%，抑制作用類似于替加氟組。通過進一步透射電鏡觀察后發現，消痰散結方組及替加氟組腫瘤細胞均出現凋亡狀態，細胞膜不連貫，細胞核出現固縮，染色體異染色質聚集，線粒體結構破壞，嵴結構消失，內質網擴張，胞質中出現大量空泡。在正常細胞代謝活動中，細胞凋亡和增殖處于一個動態平衡狀態，當細胞凋亡程序受到抑制就有可能產生腫瘤。研究結果表明，消痰散結方能影響胃癌細胞的超微結構，可誘導其凋亡從而達到抑制胃癌的作用，為消痰散結方干預胃癌的作用機制提供了細胞生物學水平的驗證。

參考文獻：

[1] 李相勇，魏品康.金龍蛇口服液治療晚期胃癌的療效觀察[J].湖北中醫雜志，2001，23（11）：3-5.

[2] 葉敏，孫大志，魏品康.消痰散結方對MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤微衛星不穩定的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2013，20（12）：32-34.

[3] 周昱岐，葉敏，呂燦，等.消痰散結方對人結直腸癌HCT116細胞增殖和凋亡及Caspase3蛋白表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2015， 22（3）：60-64.

[4] Blumenthal RD. Chemo sensitivity.Volume 2. In vivo models， imaging， and molecalar regulators （Methods in Molecular Medicine）[M]. Totowa：Humana Press，2005：323-335.

[5] Changting Meng， Hongyan Yin， Zhao Sun， et al. Adjuvant chemotherapy with docetaxel， cisplatin， and continuous-infusion 5-fluorouracil for gastric cancer：A phase Ⅱ study[J]. Translational Oncology，2014，7（2）：277-283.

[6] Akira Tsuburaya， Kazuhiro Yoshida， Michiya Kobayashi， et al. Sequential paclitaxel followed by tegafur and uracil （UFT） or S-1 versus UFT or S-1 monotherapy as adjuvant chemotherapy for T4a/b gastric cancer （SAMIT）：a phase 3 factorial randomised controlled trial[J]. The Lancet Oncology，2014，15（8）：886-893.

[7] Chen D， Jiao XL， Liu ZK， et al. Knockdown of PLA2G2A sensitizes gastric cancer cells to 5-FU in vitro[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（13）：1703-1708.

（收稿日期：2015-01-12；編輯：華強）