養陰益氣合劑對博來霉素所致肺纖維化大鼠的影響

趙晨宇等

摘要：目的 觀察養陰益氣合劑對博來霉素所致肺纖維化大鼠的影響，探討其可能的作用機制。方法 將SPF級SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和養陰益氣合劑低、中、高劑量組。采用氣管內滴注博來霉素方法復制肺纖維化大鼠模型，造模后1 d，各給藥組給予相應藥物灌胃。分別于第7、14、28日取肺組織，Masson染色觀察病理變化，堿水解法檢測羥脯氨酸（HYP）含量，Western blot檢測基質金屬蛋白酶-9 （MMP-9）和基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）蛋白表達。結果 造模7 d，病理切片顯示模型組大鼠肺部膠原較正常組明顯增多，即造模成功；HYP含量同步顯著升高（P<0.01）；造模28 d，病理切片顯示模型組肺泡間隙膠原大量沉積，部分肺泡結構喪失，HYP含量仍處于高值（P<0.01）。經養陰益氣合劑中、高劑量28 d干預治療，肺組織膠原沉積均有所改善，且表現出劑量相關性，HYP含量明顯減少（P<0.01），養陰益氣合劑高劑量組表現出與陽性藥組相當的效果。Western blot檢測結果顯示，造模7 d在正常肺組織低表達的MMP-9和TIMP-1蛋白水平顯著升高（P<0.05），至28 d持續處于高表達狀態（P<0.05）。與模型組比較，第14日養陰益氣合劑高劑量組MMP-9水平明顯降低（P<0.05），第7、14、28日TIMP-1表達水平明顯降低（P<0.05）。結論 養陰益氣合劑能有效抗肺纖維化，推斷其通過抑制TIMP-1和MMP-9的表達，調控促進膠原的水解，抑制膠原蛋白的沉積，最終抑制肺纖維化。

關鍵詞：養陰益氣合劑；肺纖維化；羥脯氨酸；基質金屬蛋白酶；基質金屬蛋白酶抑制劑；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.018

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0063-05

Effects of Yangyin Yiqi Mixture on Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Rats ZHAO Chen-yu1，2， ZHU Yong3， ZHOU Ji-pu3， CHEN Dong4， YIN Wen1， LI Zhi-yong1， WANG Hong5 （1.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China；2.Dandong School of Traditional Chinses Medicine， Dandong 118000， China；3.Beijing TCM Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China；4.Xinglong TCM Hospital， Xinglong 067300， China；5.Shunyi TCM Hospital Affiliated to Beijing TCM Hospital， Beijing 101300， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of Yangyin Yiqi Mixture on pulmonary fibrosis caused by bleomycin in rats；To discuss its possible mechanism. Methods SD rats were randomly divided into normal control group， model group， dexamethasone acetate group， low-dose， middle-dose and high-dose Yangyin Yiqi Mixture groups. Bleomycin was used to establish pulmonary fibrosis rat models through endotracheal instillation. One day after molding， each medication group received gavage with relevant medicine. Lung tissues were taken on the 7th， 14th and 28th day. Masson staining was used to observe pathological change；alkalinehydrolysis was used to detect HYP content；Western blot was used to detect the protein expressions of MMP-2 and TIMP-1. Results Compared with the normal control group， on 7th day， collagen in lung tissue of rats in model group markedly increased；the content of HYP in lung tissue significantly increased （P<0.01）. On 28th day， collagen was deposited diffusely and the alveolar was destroyed；content

基金項目：北京市中醫藥管理局科技項目（JJ2010-01）

通訊作者：王洪，E-mail：wanghong30888@163.com

of HYP in lung tissue increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， deposited collagen in lung tissue was alleviated， and the content of HYP were remarkable reduced in middle and high dose Yangyin Yiqi Mixture groups and displayed dose-dependent. Western blot results showed that the protein expressions of MMP-2 and TIMP-1 increased quickly compared with the low expression of normal lung tissue in the 7th day of molding （P<0.05）， and reached high expression in the 28th day. Compared with the model group， the level of MMP-9 in high-dose Yangyin Yiqi Mixture group decreased significantly in the 14th day；the expression of TIMP-1 decreased significantly in the 7th， 14th and 28th day （P<0.05）. Conclusion Yangyin Yiqi Mixture can effectively resist pulmonary fibrosis， which may be realized by inhibiting the expressions of TIMP-1 and MMP-9， regulating and promoting collagenic hydrolysis and restraining deposition of collagen.

Key words：Yangyin Yiqi Mixture；pulmonary fibrosis；hydroxyproline；matrix metalloproteinases；inhibitors of matrix metalloproteinases；rats

養陰益氣合劑為首都醫科大學附屬北京中醫醫院名老中醫溫振英主任醫師處方，主要由黃芪、黨參、北沙參、黃精、玄參等中藥組成。該方可有效改善肺功能，對特發性肺纖維化、氣陰兩虛證有一定療效[1]，對早期糖尿病腎病、口腔扁平苔蘚、兒童哮喘、SARS患者恢復均有較好的療效[2-6]。因此，我們推測抗炎是養陰益氣合劑的主要治療作用之一。肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）早期炎性反應，其實質是肺泡損傷，導致后期細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的膠原在肺泡和肺間質內沉積，最終發生PF。統計資料顯示，PF 5年生存率低于50%，10年生存率約30%[7]。目前醫學界最有效的治療方法是肺移植，尚缺乏特效的治療藥物[8-9]。本實驗以博來霉素（bleomycin，BLM）所誘導的PF大鼠為模型，依據病理檢測評價養陰益氣合劑對大鼠PF形成的干預作用，Western blot檢測肺組織中基質金屬蛋白酶-9 （MMP-9）和基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）表達變化，探討其可能的作用機制，為養陰益氣合劑臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SPF級SD大鼠180只，體質量（200±20）g，6周齡，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCKK（京）2012-0001。12 h交替晝夜循環，恒溫（22 ℃）、恒濕（50%）環境常規飼養。

1.2 藥物

養陰益氣合劑，首都醫科大學附屬北京中醫醫院，批號20130130；醋酸地塞米松片，天津力生制藥股份有限公司，批號1209028；注射用鹽酸博來霉素，日本化藥株式會社，批號420202。

1.3 主要試劑與儀器

Masson三色染色液，羅基北京生物技術有限公司，批號130717；羥脯氨酸（HYP）試劑盒（堿水解法），南京建成生物工程研究所，批號20130412；MMP-9山羊多克隆抗體、TIMP-1兔多克隆抗體，美國Santa公司；β-actin小鼠單克隆抗體、山羊抗兔HRP標記、兔抗山羊HRP標記，北京中杉金橋生物技術有限公司。TE16721倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）， FlexStation 3微孔板檢測系統（美國Molecular Devices公司），垂直電泳系統（北京百晶生物技術有限公司），Powerpachv Power、170-3940半干濕轉膜儀、金屬加熱器（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組及造模

SD大鼠適應性飼養7 d后，按體質量隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和養陰益氣合劑低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組）。參照文獻[10]方法，10%水合氯醛溶液0.3 g/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于解剖板上，剪去頸部被毛，常規消毒，剪約1 cm的切口，逐層暴露氣管，靜脈輸液針經氣管軟骨間隙向心端刺入，盡可能接近氣管分叉處，快速注入BLM生理鹽水溶液后立即注入0.3 mL空氣，注射后立即拔出針頭，豎起解剖板，使動物直立并左右緩慢旋轉2 min，使藥液在兩肺中盡可能分布均勻，縫合皮膚，局部消毒。正常組注入等體積生理鹽水。

1.5 給藥

造模次日，正常組和模型組予蒸餾水1 mL/0.1 kg灌胃；陽性藥組予醋酸地塞米松，前3 d給藥1 mg/kg，后3 d給藥0.8 mg/kg，之后每2 d逐漸減少，劑量為0.6、0.4、0.2、0.1 mg/kg，第14日停止給藥；中藥低、中、高劑量組大鼠給藥劑量按原藥材計算分別為11、22、44 g/kg（相當于成人用藥劑量1.76、3.52、7.04 g/kg），給藥體積為1 mL/0.1 kg。

1.6 Masson染色方法

分別于給藥后第7、14、28日，各組取1/3大鼠用于實驗檢測。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后仰臥位固定于解剖板上，打開胸腔，結扎右肺主支氣管，取完整右肺，于-80 ℃冰箱凍存；將平口針頭由心尖進入右心室，止血鉗固定后，剪開左心耳，快速灌注PBS 100～200 mL，再緩慢灌注4%甲醛溶液，至左心耳流出無色液體，取出完整左肺，于4%甲醛溶液中固定。常規石蠟包埋，切片，進行Masson染色。

1.7 肺組織中羥脯氨酸含量測定

取肺組織100 mg左右，采用堿水解法測定肺組織勻漿中HYP含量，測定方法按照試劑盒說明書步驟進行。

1.8 Western blot檢測基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶抑制劑-1的表達

取肺組織樣品100 mg，液氮速凍后在玻璃研缽中充分研磨，加蛋白裂解液500 μL，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，即總蛋白樣本。按BCA蛋白定量試劑盒操作方法進行蛋白定量，跟據上樣量進行分裝，每次上樣體積約為20 μL，置于-20 ℃保存。上樣前加入buffer，100 ℃加熱5～10 min。將處理好的樣品加入濃縮膠的梳孔中，開始電泳，初始電壓為80 V，待樣品完全進入分離膠后增至120 V，溴酚藍到達分離膠底部時電泳完畢。依照Marker估計目的條帶的位置切取膠，依次安放轉印夾層（濾紙-凝膠-膜-濾紙），將轉印夾層平行放至半干濕轉膜儀內，接通電源，根據膜的面積大小以1 cm2/0.8 mA比例恒流轉移0.5～1 h。取轉膜后的PVDF膜，用5%脫脂奶粉，室溫上下搖擺2 h（或4 ℃過夜）封閉；用新鮮配制的5%脫脂奶粉封閉液稀釋一抗（1∶500），將PVDF膜浸入一抗孵育，室溫上下搖擺2 h（或4 ℃反應過夜），孵育完畢，用1×TBST洗膜3次，每次15 min；根據一抗，選用合適的二抗，用新鮮配制的5%脫脂奶粉封閉液配制二抗反應液（1∶1500），將PVDF膜浸二抗反應液，室溫上下振蕩1 h，孵育完畢，用1×TBST洗膜3次，每次5 min，準備顯影。將載有蛋白的PVDF膜放入暗盒中，滴加發光液（A和B發光液等量均勻混合）于膜上，濾紙吸去多余發光液；于暗室中取膠片覆蓋于膜上，關閉暗盒，進行曝光；曝光完成后立即把膠片放入顯影液中，往復振蕩，待出現條帶后終止顯影，水沖去殘留顯影液，再放入定影液中定影，以膠片透明為止，水沖去殘留定影液，室溫晾干。

1.9 統計學方法

采用SAS8.1統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 養陰益氣合劑對肺纖維化大鼠肺膠原沉積的影響

正常組大鼠肺部結構正常，肺泡間有少量膠原；模型組大鼠，造模7 d時肺部膠原已明顯增多，28 d時膠原大量增生，肺泡結構被破壞，并逐漸向肺間質延伸、聚集；陽性藥組大鼠肺部膠原聚集狀況明顯輕于模型組，但肺泡存在塌陷萎縮；中藥高、中劑量組較模型組PF程度明顯減輕，中藥高劑量組尤為明顯，膠原沉積狀況有顯著改善，肺泡結構基本趨于舒展完整；養陰益氣合劑低劑量與模型組相比，大鼠肺部膠原沉積的狀況略有緩解。結果見圖1、圖2。

2.2 養陰益氣合劑對肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的影響

造模7 d，模型組大鼠肺組織中HYP含量較正常組明顯增多（P<0.01）；造模28 d，模型組肺組織中HYP仍處于高水平狀態（P<0.01），中藥中、高劑量組HYP含量降低P<0.01）。結果見表1。

2.3 養陰益氣合劑對肺纖維化大鼠肺組織基質金屬蛋白酶-9蛋白表達的影響

MMP-9在正常肺組織處于低表達狀態。模型大鼠肺組織MMP-9表達水平升高，造模7、28 d與正常組比較差異顯著（P<0.05）。14 d中藥高劑量組MMP-9升高水平明顯低于模型組（P<0.05）；造模28 d表達水平仍處于較穩定的狀態。陽性藥組在損傷起始階段MMP-9表達升高，在干預過程中始終接近模型組水平（P>0.05）。結果見圖3。

2.4 養陰益氣合劑對肺纖維化大鼠肺組織基質金屬蛋白酶抑制劑-1蛋白表達的影響

TIMP-1在正常肺組織中低表達。造模7 d TIMP-1顯著升高（P<0.05），14、28 d持續處于高表達狀態（P<0.05）。中藥高劑量組TIMP-1表達水平接近正常組，顯著低于各時點模型組（P<0.05）。陽性藥組TIMP-1表達水平與模型組相當，僅在造模28 d出現下降，但與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖4。

3 討論

PF的發生與多種因素相互作用或刺激有關，如家族性遺傳、氧化應激與炎性反應、持久性急性呼吸窘迫綜合征、長期吸入二氧化硅及BLM的毒副作用等均可誘發PF。BLM是臨床廣泛應用的化學治療輔助藥，具有顯著的細胞毒和抗癌特性。在臨床使用過程中發現，接受BLM治療的患者具有較高的PF發病率。深入研究發現BLM能導致肺泡上皮DNA損傷，并促進趨化因子釋放和活化白細胞而誘發PF[11]，使用BLM制備PF模型是目前國際上研究PF的最常用方法，由其誘導的PF已被證實與遺傳背景和氧化應激狀態等有關[12]。PF患者肺組織中MMPs和TIMPs處于不平衡狀態，細胞因子和轉化生長因子誘導的Notch信號均上調，膠原蛋白在肺實質過度沉積[13]。本實驗采用于氣管下部注入1.5 mg/kg BLM誘發PF大鼠模型[10，14]，結果顯示BLM能誘導大鼠PF形成，肺組織經Masson染色呈藍色，肺間質內均出現大量膠原纖維沉積。

為量化評價PF模型和藥效，對大鼠肺組織中HYP進行定量檢測。HYP是膠原蛋白特征性成分，而膠原蛋白是構成組織中膠原纖維的主要成分。PF過程即是膠原不斷沉積過程，因此，肺組織中HYP含量被廣泛用于對PF的研究，可以有效說明膠原纖維增多。本實驗中，造模后各個時間點大鼠肺組織中HYP含量均高于正常組，7、28 d模型組更加顯著（P<0.01），說明給予BLM之后肺組織中膠原纖維含量明顯增加；中藥低、中、高劑量均能減少同期大鼠肺組織中HYP含量，說明養陰益氣合劑能夠抑制PF過程中膠原的產生，或加速其降解，而達到對PF的治療作用。