3種蕓薹屬植物ROH1基因的克隆及分析

張賀翠 廉小平 柳菁 李幫秀 周燕

摘要 ?[目的]通過PCR和RTPCR技術從甘藍、白菜和蘿卜中擴增ROH1基因序列，分析該基因的基本特性。 [方法]采用生物信息學的相關方法進行分析。[結果] 甘藍、白菜、蘿卜ROH1基因沒有內含子，甘藍ROH1基因編碼398個氨基酸，白菜和蘿卜ROH1基因均編碼400個氨基酸，3種植物的ROH1蛋白序列與擬南芥已經公布的ROH1（At1g63930）蛋白氨基酸缺少一段連續的氨基酸序列;ROH1屬于DUF793蛋白超家族，它沒有跨膜結構域和信號肽，二級結構主要由α螺旋和無規則卷曲構成。同源比對及功能聯想分析發現植物中ROH1非常保守，系統發育分析表明甘藍、白菜和蘿卜的關系最近;結構功能分析發現ROH1可能與BYPASS蛋白和AT4G11300蛋白的功能相似。[結論] 為研究DUF793蛋白超家族功能提供參考。

關鍵詞 ROH1基因;基因克隆;DUF793蛋白超家族

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-018-04

Cloning and Analysis of ROH1 from Three Brassica Plants

ZHANG Hecui， LIAN ?Xiaoping， LIU Jing et al

（College of Agronomy and Biotechnology ， Southwest University ， Chongqing 400716）

Abstract ? [Objective]The sequences of ROH1 genes were amplified by PCR and RT-PCR from three Brassica plants which are Brassica oleracea， Brassica rape and ?Raphanus sativus. [Method]Using relevant methods of bioinformatics analyzes. [Result] The results indicated that the gDNA of ROH1 was without introns， ROH1 gene encodes 398 amino acids in Brassica oleracea when it encodes 400 amino acids in the Brassica rape and Raphanus sativus. A continuous period of amino acids was deleted from the ROH1 in the three plants which were compared to ROH1 （At1g63930） in Arabidopsis thaliana; ROH1 belonged to DUF793 protein superfamily， and it might not be a transmembrane domain with no a signal peptide. The secondary structure of ROH1 mainly composed of αhelix and random coil constituted. Homologous alignment and function of the association analysis showed that ROH1 was very conservative， and phylogenetic analysis showed that there were closely relationship between Brassica oleracea， Brassica rape and ?Raphanus sativus; The structure and function analysis found that ROH1 may resemble to BYPASS protein and AT4G11300 protein . [Conclusion] The study provided a reference for the study of function about DUF793 protein super family.

Key words ?ROH1 gene; Gene clone; ?DUF793 protein super family

基金項目 中央高校基本業務費專項經費（XDJK2013C121）

作者簡介 張賀翠（1985- ），女，河南滑縣人，助理實驗師，碩士，從事生物化學與分子生物學方面的研究。

收稿日期 20141125

囊泡分泌和轉運過程是真核細胞生命活動的基本事件之一，是神經信號傳導和內分泌激素釋放的基礎，細胞內大多數重要的信號蛋白或者膜蛋白需要借助囊泡的轉運和分泌來實現^[1]。囊泡轉運和分泌過程中，由多亞基組成的7類復合物被證明在真核細胞的內膜轉運和囊泡拴系過程中發揮重要作用。其中研究最為活躍和進展最快的是Exocyst，它是由SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70 和 EXO84 8亞單位構成^[2]。

Elias等^[3]首先從水稻和擬南芥中發現了EXO70A1，它是EXO70家族中的一員。Li等^[4]研究顯示EXO70A1介導的膜泡運輸參與了導管細胞次生壁的形成，EXO70A1突變導致導管運輸功能障礙，進而影響擬南芥的生長和育性，SEC8則和Exo70、SEC6形成一個穩定的亞復合體。Ivan等^[5]在擬南芥中發現EXO70A1和SEC8同時與另一種蛋白ROH1相互作用，ROH1突變引起種子中果膠沉積的消失;擬南芥ROH1（At1g63930）基因沒有內含子，編碼415個氨基酸，屬于一種未知功能的DUF793蛋白家族成員之一，DUF793家族在擬南芥中至少含有11個成員，分別為At1g01550，At1g18740，At1g22030，At1g43630，At1g74450，At1g77855，At2g46080，At4g01360，At4g11300，At4g23530;據預測ROH1與BYPASS1（At1g01550）基因的結構具有高度相似性，BYPASS1與根冠的運輸有關，因此ROH1蛋白可能參與囊泡轉運^[6]。但目前對甘藍、白菜和蘿卜ROH1蛋白編碼序列及其蛋白質結構的研究尚未見報道。

筆者以高度自交不親和甘藍E1、白菜和蘿卜為材料，利用PCR和RTPCR的方法，首次對甘藍、白菜和蘿卜的ROH1蛋白編碼序列進行了克隆與序列分析，進一步了解該編碼序列的結構與功能，并探究ROH1序列及其編碼的蛋白質在甘藍、和擬南芥中存在的結構和功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為高度自交不親和甘藍E1、白菜和蘿卜。

1.2 方法 利用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京）提取甘藍葉片gDNA。各個時期柱頭和其他組織RNA的提取參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（Tiangen，北京）操作說明進行。使各種材料RNA量相同，以等體積Oligo dTprimers和random6 mers混合物為引物，參照Primescript反轉錄試劑盒（TakaRa，日本）操作說明合成cDNA第一條鏈。反轉錄完成后，-20 ℃保存備用。

以甘藍、白菜和蘿卜的gDNA和cDNA為模板擴增ROH1基因，ROH1上游引物：CGCAAGTAATCAAGGCTCG，下游引物：GAAACTTTCCCGGCTTGCTC，反應參數：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環;72 ℃ 10 min終止。擴增產物經1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以DNA膠回收試劑盒純化回收。產物回收后與T載體連接，將重組克隆載體導入大腸桿菌感受態DH5α中，挑取陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 數據分析

序列分析和系統分析分別采用VecoterNTI、MEGA6，在線分析軟件分別使用NCBI、COILS、TMHMM2.0、SignalP、GeneMANIA等。

2 結果與分析

2.1 ROH1基因克隆及進化分析

以甘藍E1、白菜、蘿卜為材料，利用PCR及RTPCR擴增產物ROH1，連接PMD19-T載體，送華大基因組測序，結果表明，ROH1的全長gDNA序列與cDNA序列完全一致，均為1 197 bp;蘿卜和白菜的全長gDNA序列與cDNA序列長度均為1 203 bp，完全等同于1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳的結果（圖1）。

經測序和比對發現（圖2），甘藍中ROH1編碼區序列和gDNA序列都是由1 197 bp構成，表明甘藍中ROH1沒有內含子，編碼398個氨基酸;蘿卜和白菜的核苷酸序列長度均

注：M.Marker，1.甘藍gDNA，2.甘藍gDNA，3.白菜gDNA，4.白菜gDNA，5.蘿卜gDNA，6.蘿卜cDNA。

圖1 ROH1的cDNA 和gDNA的PCR產物電泳圖譜

注：Bo.甘藍;Br.白菜;At.擬南芥;Rs.蘿卜。

圖2 ROH1蛋白氨基酸的序列比對

安徽農業科學 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

為1 203 bp，編碼400個氨基酸。通過NCBI下載擬南芥ROH1 基因序列（序列號：At1g63930），經blast及VecoterNTI與已公布的擬南芥ROH1氨基酸序列比對發現，4條序列的相似性達到87.6%，說明ROH1基因的保守型很強。甘藍中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達到92%，白菜中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達到89.5%，蘿卜中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達到90.2%;甘藍中ROH1氨基酸序列比擬南芥中的ROH1氨基酸序列少17個氨基酸殘基，其中甘藍第56、57位點氨基酸比擬南芥中ROH1多2個氨基酸殘基，甘藍第299位點氨基酸比擬南芥中ROH1氨基酸序列少1個氨基酸殘基，甘藍中ROH1比擬南芥中少一段連續的16個氨基酸序列，對應于擬南芥序列第191～208位點氨基酸殘基，序列為GGGGGNKTTERSWSFGR。白菜和蘿卜第56～58位點氨基酸比擬南芥ROH1多3個氨基酸殘基，同樣在對應于擬南芥第192～208位點氨基酸處少一段連續的氨基酸序列，序列為GGGGGGNKTTERSWSFGR。結構域預測發現，蘿卜、甘藍、白菜和擬南芥中的ROH1基因與DUF793蛋白質超家族的結構一致性很高（圖3）。

圖3 ROH1蛋白結構域預測

進化樹可以描述來自于同一祖先的不同植物在進化過程中的關系，通過構建物種進化樹，可以了解某種物種在進化過程中的地位。依據氨基酸序列構建的分子進化樹能較真實地反映不同物種之間的系統分類學關系和自然演化進程，對明確判斷物種間的親緣關系具有一定的參考價值。利用MEGE6軟件對DUF793蛋白超家族的多個物種構建進化樹，由圖4可知，在DUF793家族進化樹中，甘藍、白菜和蘿卜

注：Bo.甘藍;Br.白菜;At.擬南芥;Rs.蘿卜;At4g11300等見表1。

圖4 多個物種DUF793蛋白超家族氨基酸進化樹分析

ROH1蛋白聚在一起，和油菜、擬南芥聚在一支，說明甘藍、白菜和蘿卜

ROH1蛋白可能與AT4G11300具有相似的功能。

2.2 ROH1卷曲螺旋及跨膜結構域分析

對ROH1二級結構預測發現（表2），甘藍、白菜和蘿卜中ROH1的二級結構可能存在α螺旋、β轉角、無規則卷曲、延伸鏈，其中α螺旋占整條序列二級結構的比例最高，其次是無規則卷曲，β轉角和延伸鏈占的比例非常小，由此可知，ROH1的二級結構主要由α螺旋和無規則卷曲構成。

蛋白質卷曲螺旋是一種超二級結構，通常由2～7個α-螺旋互相纏繞形成麻花狀結構，其中2個或4個α-螺旋互相纏繞最為常見，含卷曲螺旋結構的蛋白質是纖維狀蛋白質的主要結構模式，在植物生命體中具有重要意義。通過在線分析工具COILS 對甘藍、白菜和蘿卜ROH1進行預測，結果見圖5。由圖5可知，3個物種的ROH1在對應于甘藍氨基酸350～380處均存在卷曲螺旋結構。

用TMHMM2.0預測甘藍、白菜和蘿卜ROH1蛋白無明顯跨膜區（圖6），蛋白全部位于膜外。用SignalP分析ROH1的信號肽，通過不斷截短的方式最后發現ROH1沒有信號肽。

2.3 ROH1信號路經分析

GeneMANIA可以發現信號途徑或蛋白復合體的新成員，可作為蛋白篩選結果的補充。使用該工具對ROH1進行檢索，結果見圖7。由圖7可知，擬南芥中發現ROH1與EXO70家族的EXO70A1和EXO70E2相互作用，數據庫中還存在18種與ROH1蛋白共沉淀、共表達和具有相同結構域的蛋白。數據庫中有8種蛋白與ROH1具有相同的結構域，這些蛋白均屬于DUF793蛋白超家族，大多數為功能研究較少的蛋白，其中

AT2G46080和AT1G22030編碼類BYPASS蛋白。AT1G43630、AT1G74450、AT1G01550

與形態發育有關;AT4G23530、AT2G46080、AT1G18740是與

表1 多個物種的信息

序列號物種序列號物種

XP_007222897.1Prunus persicaBAF29255.1Oryza sativa Japonica Group

XP_004173411.1Cucumis sativusQ9LMM6.1Arabidopsis thaliana

CBI34385.3Vitis viniferaAEE29757.1Arabidopsis thaliana

XP_006305065.1Capsella rubellaAt1g77855Arabidopsis thaliana

XP_006434464.1Citrus clementinaAT4G23530Arabidopsis thaliana

KDO86277.1Citrus sinensisAt4g11300Arabidopsis thaliana

XP_006413544.1Eutrema salsugineumAEE82015.1Arabidopsis thaliana

NP_001240854.1Glycine maxAT2G46080Arabidopsis thaliana

NP_001144572.1Zea maysAT1G74450Arabidopsis thaliana

AET04440.1Medicago truncatulaAT1G43630Arabidopsis thaliana

XP_007160104.1Phaseolus vulgarisAT1G22030Arabidopsis thaliana

XP_008365274.1Malus domesticaAtROH1Arabidopsis thaliana

EES19085.1Sorghum bicolor

表2 ?3種不同植物ROH1蛋白二級結構預測結果%

名稱α螺旋延伸鏈β轉角無規則卷曲

BoROH154.529.304.7731.41

BrROH160.753.501.7534.00

RsROH160.004.002.0034.00

囊泡運輸有關的蛋白;AT1G22030、AT4G11300是與Exocyst有關的蛋白;AT1G74450、AT1G01550是與根系形態發育有關的蛋白。與進化樹分析結果一致。

3 討論

甘藍ROH1基因編碼398個氨基酸，白菜和蘿卜ROH1基因編碼400個氨基酸，均比擬南芥ROH1少一段連續的氨基酸序列，可能是物種進化中自然選擇造成的，因此這3種植物ROH1在進化上較接近，在DUF793進化樹中聚在

一支而與擬南芥較遠。在對甘藍、白菜和蘿卜ROH1蛋白的二級結構預測中，發現3種植物ROH1都沒有跨膜結構，ROH1可能主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，存在卷曲螺旋超二級

注：綠、藍、黃線分別表示不同尺寸窗口的預測。

圖5 ROH1卷曲螺旋預測

圖6 ROH1跨膜結構預測

圖7 ROH1蛋白的功能聯想數據分析

結構^[7]，預測有一定

的準確度且ROH1蛋白的氨基

酸序列的疏水性不是很強，可能預測不出來。信號肽是新合成多肽鏈中用于指導蛋白質跨膜轉移的N-末端的氨基酸序列，一般由 16～26 個氨基酸組成，包括一個帶正電荷的 N-末端，一個中間疏水序列和一個較長的帶負電荷的 C-末端，通過不斷截短的方式預測發現ROH1蛋白沒有信號肽。

ROH1是Ivan等利用酵母雙雜交、定點突變等技術從擬南芥中篩選出來的蛋白，它與Exocyst復合體中的EXO70A1、EXO70E2和SEC8相互作用，通過與EXO70家族基因之間的共調控表明ROH1和Exocyst復合體之間存在某種聯系;據Ivan推測ROH1的突變可以引起種皮果膠的沉積，破壞了種皮的正常功能，因此ROH1可能是分泌的負調節因子。ROH1屬于DUF793蛋白超家族，通過GeneMANIA 預測發現與ROH1有共同結構域的8種蛋白質均屬于DUF793家族，其中5種蛋白與分泌和囊泡運輸有關;Van等^[8]研究發現ROH1與BYPASS1（At1g01550）基因的結構具有高度相似性，BYPASS1與根冠的運輸有關;Kang等^[9]推測BYPASS及其同源基因在不同物種和不同組織中具有不同的生物學功能;其他研究結果也表明BYPASS可能廣泛參與了各種生理活動^[9-10]。劉豫東等^[11]從甘藍的柱頭內擴增出BYPASS基因，據推測BYPASS蛋白可能參與了甘藍的生殖發育過程;AT2G46080和AT1G22030編碼類BYPASS蛋白與ROH1蛋白具有相同的結構域，因此ROH1蛋白也可能與根冠運輸和生殖發育有關。進化分析發現甘藍、蘿卜、白菜ROH1蛋白可能與DUF793蛋白超家族的AT4G11300蛋白功能相似^[12]，AT4G11300蛋白與Exocyst相關（raghvendra），與Ivan等發現的ROH1和Exocyst復合體之間存在某種聯系這個觀點一致，同時說明DUF793蛋白家族可能具有抑制分泌的功能。

應用生物信息學的方法對 ROH1 的結構和功能進行預測和分析，有利于利用試驗的手段研究植物ROH1 的分子生物學性質和理化性質，對物種間 ROH1家族的親緣關系和遺傳相似性的分析，對新ROH1基因的發現和研究有較大的幫助^[13]。Ivan等在擬南芥中發現ROH1蛋白與EXO70A1、

EXO70E2和SEC8相互作用，甘藍、白菜、蘿卜ROH1蛋白比擬南芥ROH1蛋白少一段連續的氨基酸序列，因此甘藍、白菜、蘿卜ROH1與Exocyst復合體亞基是否存在相互作用，ROH1是否與分泌和囊泡運輸有關，ROH1是否與生殖發育

有關，這些都是下一步研究的內容，以期為研究DUF793蛋白超家族功能提供參考。

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