農桿菌介導創傷胚轉化的應用

張麗君 劉龍龍 張建珍 孫毅 康國帥 周建平 崔林

摘要

[目的] 優化農桿菌介導創傷胚轉化的方法，提高轉化率，培育具有特定功能的轉基因品種，改善作物的生存能力和生態環境適應力。[方法]參照農桿菌劃胚介導植物萌發種子基因轉化方法，以燕麥、玉米和高粱的萌發種子為試驗材料，農桿菌菌株LBA4404（含質粒P3301ubiAc）侵染轉化燕麥、玉米和高粱的萌發種子，優化轉化條件，探索燕麥、玉米和高粱遺傳轉化體系，探討菌液濃度、種子萌發時間、超聲波功率、乙酰丁香酮和草丁膦濃度對3種作物的影響并進行比較分析。[結果]農桿菌菌液濃度為0.6>OD600≥0.4 時轉化效果最佳;第1次超聲波功率為900 W，處理時間為10 min;第2次超聲波功率為200 W，處理時間為4 min效果最佳。轉化效率最高;添加乙酰丁香酮對燕麥、高粱和玉米的發芽有明顯促進作用，但轉化效果有明顯區別;燕麥、玉米和高粱的轉化植株對草丁膦的耐受性差異不大，與非轉化植株相比，0.8 mg/L 除草劑脅迫下燕麥、玉米和高粱種子萌發受到一定程度的抑制。用1 mg/L 除草劑溶液對T₀和T₁代轉化植株幼苗進行篩選，轉化植株的存活率高于對照。[結論]經除草劑篩選和PCR對T₀和T₁代幼苗檢測，初步證明獲得了轉化植株。

關鍵詞 植物轉化;燕麥;玉米;高粱

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-025-04

Trauma Embryo of Genetic Transformation System with Agrobacterium Mediated Method

ZHANG Lijun1，2， LIU Longlong¹，ZHANG Jianzhen²， CUI Lin1* et al

（1. Crop germplasm resources research institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau， Ministry of Agriculture， P. R. China， Taiyuan， Shanxi ?030031;2. Research Institute of Applied Biology，Shanxi University，Taiyuan，Shanxi ?030001）

Key words [Objective]The purpose was to optimize agrobacteriummediated plant germination seed transformation method，increase conversion rate， breed GM varieties with specific functions， and improve viability and adaptability of crops. [Method]This paper consulted agrobacteriummediated plant germination seed transformation method and selected germinating seeds of oat， maize and sorghum as test materials. Germinating seeds of oat， maize and sorghum were infected and transformed by agrobacterium strain， which included plasmid P3301ubiAc. Transformation conditions were optimized. Genetic transformation systems of oat， maize and sorghum were studied. Concentration of bacterium， seed germinating time， ultrasonic power， and influence of concentration of acetosyringone and glufosinate on the above three crops were compared and analyzed. [Result]The experiment showed that when 0.6>OD600≥0.4， transformation achieved the best effect; Ultrasonic power was 900 W at the first time and treatment time was 10 minutes; Ultrasonic power was 200 W at the second time and transformation achieved the best effect when treatment time was 4 minutes; Acetosyringone could affect germination of oat， sorghum and maize significantly. It could increase transformation rate of maize and lower that of sorghum， but for oat， its effect was not obvious; in terms of tolerance to glufosinate， the difference was not significant among transformed plants of oat， maize and sorghum. Compared with nontransformed plants， seed germination of oat， maize and sorghum were restrained to some degree under the stress of 0.8 mg/L herbicide solution. With 1 mg/L herbicide solution to select seedlings of T₀ and T₁ transformed plants， the result showed survival rates of transformed plants is higher than those of control group. [Conclusion ]After herbicide selection and PCR test on T₀ and T₁ seedlings， it was proved preliminarily that transformed plants were got.

Key words Plant transformation;Oat;Maize;Sorghum

基金項目 國家燕麥蕎麥產業技術體系（CARS08A1）;山西省農科院博士基金項目（YBSJJ209）。

作者簡介

張麗君（1981-），女，河北行唐人，助理研究員，博士，從事燕麥遺傳育種研究。*通訊作者 。

收稿日期 20141203

隨著生物技術的快速發展，植物基因工程在農作物品種改良中的應用越來越受到人們的重視，利用植物基因工程改良植物品質、增強抗性等是一種行之有效的方法，以彌補常規育種技術的不足，縮短育種周期。因此利用基因工程育種技術可加速選育出優質、抗逆的轉基因新品種，滿足山西高原生態建設和農業生產的需求。

農桿菌介導種子萌發的方法^[1]是以植物萌發種子為受體，在種子萌發過程中對受體植物萌發種子生長點部位進行微創，借助于超聲波的生物學效應，引起細胞壁和質膜的破損或可逆的質膜透性改變，為細胞內外發生物質交換創造條件。萌發的種子經過超聲波處理后，立即轉移到攜帶外源基因片段的農桿菌中進行共培養，將外源基因轉移到受體基因組中，并通過對種子或幼苗的直接篩選，對植株葉片DNA進行PCR擴增和Southern雜交，進一步確定轉化株。筆者以燕麥、玉米、高粱的種子作為外植體，采用農桿菌介導種子萌發的方法，進行轉化研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?植物材料及供體質粒

植物材料為燕麥品燕2號、玉米昌7-2、 高粱晉雜5號，種子預先精選備用。質粒載體為P3301ubiAc的Cry1Ac基因;啟動子為Ubi，終止子為Nos（圖1）， 農桿菌菌株是LBA4404。標記基因為卡那霉素（Km），篩選基因為Km和鏈霉素（Streptomyces hygroscopicus）。菌株基因組中包含一個抗除草劑標記基因Bar基因。Bar 基因編碼草丁膦乙酰 CoA 轉移酶（ PAT） ，可催化草丁膦（ PPT） 的自由氨基乙?；?，從而使除草劑草丁膦失活。植物特別是單子葉植物對 Bar 基因編碼的 PAT 酶作用的底物 PPT 內源抗性較低，且Bar基因表達檢測方法較簡便，因而Bar基因也被廣泛用作植物基因轉化試驗的選擇性標記基因和分子生物學研究的報告基因。

圖1 ?質粒p3301ubiAc的物理圖譜

1.2 農桿菌的制備

取含有質粒P3301ubiAc的農桿菌菌株LBA4404單菌落接種于濃度50 mg/L Km和100 mg/L的鏈霉素LB液體培養基進行菌液培養，OD600分別設置為0.2、0.4、0.6、0.8備用（臨時放置于4 ℃保存）。

1.3 種子萌發時間對轉化的影響

將種子于0.1% 氯化汞浸泡2 min左右，70%乙醇浸泡10 min左右滅菌;最后用無菌水漂洗3～5次以上，消毒后的種子進行預培養，預培養時間為4、12、20 h，每個處理用100粒種子，重復3次。于搖床上（120 r/min）28 ℃培養，讓種子充分吸水膨脹。

1.4 超聲波處理對轉化的影響

超聲波處理分為2次：微創傷后進行第一次超聲波處理，工作頻率設置4個處理，分別為0（CK）、300、600、900 W;工作時間設置3個處理，分別為0（CK）、5、10 min，每個處理含200粒種子，重復3次;第1次超聲波處理后的微創傷種子浸泡在含有目的基因農桿菌菌液中進行第2次超聲波處理，工作頻率設置4個處理，分別為0（CK）、100、200、300 W;工作時間設置3個處理，分別為0（CK）、4、8 min。

1.5 共培養時間對轉化的影響

將第2次超聲處理后的微創傷種子浸泡在含有目的基因農桿菌菌液中，于搖床上振蕩（120 r/min）培養1～3 d，并在種胚露白后停止振蕩培養;將露白種子先用無菌水漂洗3～5次，然后播種大田中，記錄播種種子的顆粒數和出苗情況。

1.6 不同植物種子的除草劑耐受試驗

在生化培養箱中進行種子萌發試驗，培養液和補給液均為草丁膦溶液。草丁膦濃度設置為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L和8、6、4、2 mg/L，每個處理20粒種子，每個處理設3次重復。14 d后觀察種子萌發以及出芽情況。將共培養后的材料種植在大田中，到幼苗成長至4～5葉期噴霧草丁膦溶液進行除草劑篩選。7 d后調查成活苗數;20 d后再次噴霧草丁膦溶液進行篩選，7 d后調查成活苗數，成活苗可以初步認定為草丁膦抗性苗。在1 mg/L草丁膦存活的植株經自交收獲種子，每個作物選500粒種子，第2年大田播種，以未轉化種子同期播種作為對照，各品種五葉期用1 mg/L草丁膦對其進行噴灑，7 d后調查成活苗數。

1.7 ?PCR檢測

采用CTAB法^[2]提取總DNA，引物Primer1：5′CTGACCGTGACCGTGCTG3′;Primer2：5′TGGTGCCGTAGGCGAACT3′，反應程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環后，于72 ℃延伸10 min ，產物片段長度為500 bp。擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，分析擴增產物的特異性。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌液濃度對轉化率的影響

將試驗菌液濃度OD600設置為0.2、0.4、0.6和0.8。從表1可以看出，不同生長時期的農桿菌都具有轉化能力，但轉化效率有一定差別。0.4﹥OD600≥0.2時，農桿菌還處于生長期，濃度過低，對其的侵染程度有限。當農桿菌生長至對數期時，微創傷傷口自我修復完成。當0.6﹥OD600≥0.4時種子的轉化率最高，此階段農桿菌尚未達到對數生長期的旺盛期，在與種子的共培養階段，農桿菌仍處于對數生長期并很快達到旺盛期，此時微創傷傷口也未完成自我修復，從而促進TDNA轉移和整合到宿主植物基因組中;而當OD600≥0.6時，轉化率有所降低，由于菌液濃度已達到旺盛的對數生長期，在種子的共培養階段菌液的濃度仍在增長并很快達到飽和狀態，達到飽和狀態的農桿菌不利于TDNA轉移和整合到宿主植物的基因組中。由此可知，當農桿菌生長快達到對數生長期（0.6﹥OD600≥0.4） 時，轉化效率最高。

表1 菌液濃度對轉化率的影響

%

菌液濃度（OD600）燕麥高粱 ?玉米

0.4﹥OD600≥0.22.55.43.1

0.6﹥OD600≥0.47.014.99.2

0.8﹥OD600≥0.63.88.95.3

OD600≥0.81.66.12.7

2.2 種子萌發對轉化率的影響

從表2可以看出，燕麥的種子較小，種皮吸脹時間短，故萌發時間不宜太長，4 h轉化率最高，為最佳時間。玉米種子較大，8 h轉化率最高。

表2 ?種子萌發時間對轉化率的影響

%

種子萌發時間∥h燕麥高粱玉米

452.3838.7317.64

636.7962.1431.92

812.1321.1749.38

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 張麗君等 農桿菌介導創傷胚轉化的應用

2.3 超聲波對轉化率的影響

將第1次超聲波功率分別設置為0（CK）、300、600、900 W，結果表明，燕麥、高粱和玉米表現結果相一致，在第1次超聲波處理時，超聲波功率為300 W時種子的出芽率最高，隨著功率的增加而降低，可能是由于超聲波可以促進種子萌發，促使種子細胞的細胞壁和原生質發生水合，加速原生質從凝膠狀態轉變為溶膠狀態。各種酶開始活化，呼吸和代謝作用急劇增強。超聲波功率為900 W和0時，種子的發芽率接近，說明相對較低的超聲波功率對種子發芽率有促進作用。而轉化率則相反，隨著超聲波功率的增加，轉化率隨之提高（表3），說明超聲波的空化作用對促進TDNA轉移和整合到宿主植物基因組都有明顯的促進作用，超聲波處理功率為900 W時，處理時間10 min對萌發種子的轉化率最高。第1次超聲波處理后，加入農桿菌菌液進行第2次超聲波處理。第2次超聲波處理設置為0（CK）、100、200、300 W;工作時間設置3個處理，分別為0（CK）、4、8 min。第2次超聲波處理功率的對照（CK）設置為第一次超聲波處理功率900 W處理后的種子。超聲波處理本身會對農桿菌造成一定傷害，因此選擇低濃度的超聲波功率對其進行處理，結果表明，第2次超聲波功率對燕麥、玉米和高粱的轉化率都有促進作用。超聲波功率為200 W時，處理時間4 min對轉化效果最佳。

表3 ? 第1次超聲波對轉化率的影響

%

超聲波強度

W

燕麥

出芽率轉化率

高粱

出芽率轉化率

玉米

出芽率轉化率

09.331.259.3019.609.313.57

30014.5832.9514.1044.3014.1739.87

60012.0759.4913.6886.7013.9862.15

9009.1389.839.8091.508.9788.72

2.4 乙酰丁香酮對轉化率的影響

植物傷口處的細胞分泌大量的酚類化合物、中性糖，酚類化合物如乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物質既是根瘤農桿菌的趨化物，又是農桿菌中毒性基因Vir表達的誘導物，在它們的作用下，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。作為主要誘導物的AS和HO-AS等酚類物質，主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，所以在轉化過程中人為添加AS 可以促進根癌農桿菌感染單子葉植物^[3-4]。在不同超聲波功率處理后，將AS添加到共培養液中，AS對萌動種子劃胚處理后轉化率的影響見表4。由表4可知，與超聲波處理后未添加AS相比，在共培養液中加入100 μmol/L乙酰丁香酮3種作物種子出芽率明顯提高，但轉化率3種作物表現不同，燕麥中添加AS無明顯變化，玉米的轉化率有所提高，高粱的轉化率反而降低?？赡苡捎?種作物對AS濃度要求不同，導致轉化率不同。

2.5 共培養對轉化率的影響

共培養是農桿菌中TDNA攜帶外源基因進入植物細胞的關鍵時期，此過程發生之后，農桿菌的繼續存在已沒有必要，且微創傷傷口也完成了自我修復。由于轉化材料為種子，需要考慮種子的發芽情況，共培養時間以2 d較合適。共培養時間太短，農桿菌沒有充分地對植物進行轉化，轉化率較低。而共培養時間太長，胚細胞呼吸作用逐漸加強，酶的活動逐漸旺盛，加速消耗氧氣，使得共培養液中氧氣含量減少，營養情況不良并容易產生、大量積累次級代謝產物，可能產生有害物質。另外，種子發芽在移栽過程中會造成大批量種子受傷死亡。

2.6 ?除草劑對轉化率的影響

從表5可以看出，在0.8 mg/L草丁膦的脅迫下，燕麥、玉米和高粱的種子只有52%、61%和43%能夠萌發，與對照相比，萌發緩慢。在2 mg/L草丁膦脅迫下，有33%、45%和37%的種子仍能夠緩慢萌發，但已不能正常生長。大田噴霧試驗以實驗室數據為基礎，選用1 mg/L的草丁膦對其進行噴灑試驗，第1次噴灑草丁膦溶液后，對照植株有少量存活，第2次噴灑草丁膦溶液7 d后，對照幾乎全部死亡。第2年各作物五葉期用1 mg/L草丁膦對其進行噴灑試驗，從表6可以看出，T₁代轉化植株生長早期噴灑草丁膦后各作物存活率明顯高于T₀代，達50%以上。

2.7 PCR檢測

對經草丁膦篩選的抗性植株提取DNA進行PCR擴增，以提取的抗性植株DNA作為模板，用Cry1AC基因一對特異性引物進行PCR特異片段的擴增，以未轉化植株作為陰性對照，以質粒DNA作為陽性對照，進行PCR檢測。其中部分株系與陽性對照擴增出的條帶完全相同，而對照DNA則未擴增出相應的條帶，初步說明外源基因已導入植株中（圖2）。

3 ?結論與討論

在農桿菌介導的植物轉化過程中進行超聲波處理，利用超聲波的空化作用在外植體的表面和深層形成許多的微傷口，大量微傷口的存在為農桿菌的感染提供了更多的機會，使外源基因容易進入，促進TDNA轉移和整合到宿主植物的基因組中，提高農桿菌的轉化活力^[5]。但超聲波處理時間不宜太長，由于超聲波的熱化作用，使超聲波在介質中傳播時，所產生的能量會不斷地被介質吸收而使介質的溫度升高^[6] ，從而對外植體造成傷害。Santarem 等^[7]、Trick等^[8] 用掃描隧道顯微鏡觀察到經過超聲波處理的大豆子葉的表面和深層存在大量的微傷口，處理時間越長，外植體的損傷越嚴重，因此在實際利用時需要測定超聲波處理的強度和時間。在該研究中前后2次使用超聲波處理，第1次超聲波處理的目的是使種子經過超聲波處理后處于一種“感受態”的狀態，有利于促進T-DNA轉移和整合到宿主植物的基因組中，提高基因的轉化率。第2次超聲波處理的目的是使帶有目的基因的菌在超聲波處理時處于一種“避難”行為當中，從而加快T-DNA轉移和整合到宿主植物的基因組中。第1次超聲波處理功率900 W，處理時間為10 min，第2次超聲波功率為200 W時，處理時間為4 min時對轉化效果最佳。

轉基因植物的研究目的主要在于改善植物抗逆、抗除草劑等性質，提高產量和品質，作為生物反應器等方面^[9]。目前我國轉基因農作物和林木有22種，轉基因植物中轉入的性狀以抗除草劑為多，約超過40%，其次為抗蟲、抗病毒和抗逆性等性狀^[10]。在禾本科作物中，玉米建立了良好的遺傳轉換體系，具有外源基因單拷貝插入、遺傳穩定、無載體骨架插入、目的基因表達合適、對玉米自身性狀無影響等特點。國外大公司及部分公立研究機構建立了相對成熟的玉米轉基因技術體系。全球 1.77 億hm²玉米種植面積中有 32%是轉基因玉米^[11]。國內玉米轉基因技術體系研究起步較晚，初步建立了玉米規模化轉基因技術體系。與玉米相比，高粱轉基因研究工作相對滯后，遺傳轉化體系不穩定、轉化效率偏低、外源基因表達量低或不表達。高粱的未成熟胚、幼穗、莖尖以及來自未成熟胚或幼穗經誘導產生的胚性愈傷組織均是遺傳轉化的理想受體，可采用農桿菌介導法、基因槍法、電激法、花粉管通道法、顯微注射法和原生質體化學（PEG）處理法等方法進行遺傳轉化^[12]。相比之下，燕麥的轉基因處于落后狀態，目前國內外成功轉化于燕麥的基因有大麥的HVA1（甲肝外殼蛋白）基因^[13]，抗除草劑Bar基因^[14]和PPIP基因

（類產堿假單胞菌殺蟲蛋白基因）^[15]。而國內報道的只有張

藝^[15]和王迅婧^[16]均獲得了轉化植株，但均未確定外源基因在后代中能否穩定表達。農桿菌介導種子萌發方法的優點是外植體來源不受時間限制，不需要建立植株再生體系，免去組織培養等復雜的操作。目前在玉米^[17]、大豆^[18]、高粱^[19]等作物均獲得了轉基因植株，但在作物上應用還不夠成熟^[20]。農桿菌介導種子萌發方法的優化和轉化過程中的影響因素仍需進一步研究。該試驗運用植物萌發種子基因轉化法對燕麥、高粱和玉米3種作物進行遺傳轉化，建立了該方法基本的遺傳轉化條件，并對3種作物的萌發時間、菌液濃度、共培養時間、超聲波功率、乙酰丁香酮濃度、草丁膦的敏感性進行了比對，優化農桿菌介導種子萌發的方法，提高轉化效率。隨著農桿菌介導種子萌發方法的改進、轉化效率的提高，農桿菌介導種子萌發的方法將為作物分子育種和基因功能研究提供有力的方法保障。

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