焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分GlymBd 30K基因

金瑩 房保海 劉新亮 孫濤 賈俊濤 趙麗青 孫雯嫻

摘要 ?[目的] 建立一種通過焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分的方法。[方法]針對大豆GlymBd30K基因設計特異性PCR引物和焦磷酸測序引物，利用設計的特異性引物擴增各測試材料的特異基因片段并進行焦磷酸測序。 [結果]該檢測方法對大豆過敏原成分具有非常好的重現性和特異性，測序結果在GenBank中進行同源性比對分析，表明目標序列能夠作為鑒定GlymBd 30K基因很好的序列。[結論]為食品中的大豆過敏原成分快速檢測提供很好的技術支撐。

關鍵詞 焦磷酸測序;大豆;過敏原;PCR

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-029-03

The Detection of Allergen GlymBd 30K in Soybean by Pyrosequencing Technology

JIN Ying¹， FANG Baohai2*， LIU Xinliang³et al

（1.Huangdao Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong ?266555; 2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong ?266002; 3. Heilongjiang Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Haerbin， Heilongjiang ?150001）

Abstract ?[Objective]To establish a rapid method to detect soybean allergens by pyrosequencing technology. [Method] The conserved sequences for GlymBd30K gene specific PCR amplification， and then using pyrosequencing technology for PCR amplification products.Using primers design specific gene fragments in tested materials were amplified， and then pyrosequencing. [Result] The results had very good reproducibility; the sequencing results were homology found in GenBank. The target sequence to sequence as the identification of GlymBd 30K gene was very good.[Conclusions] A simultaneous quantitative detection of 96 samples by pyrosequencing rapid detection methods was Successfully established， it will provide good technical support for rapid detection of allergens for export soybeans and their products.

Key words ?Prosequencing;Soybean;Allergen; PCR

基金項目 國家質檢總局項目（2011IK221）。

作者簡介 金瑩 （1981- ），女，山東沂水人，農藝師，博士，從事食品安全方面的研究。*通訊作者，高級工程師，博士，從事食品安全檢測技術研究。

收稿日期 20141211

大豆是一種常見的食品過敏原，被稱為八大類食品過敏原之一，美國、歐盟等都要求在食品標簽中強制性標識。大豆GlymBd 30K蛋白是大豆的主要過敏蛋白，也被稱為P34蛋白或30K，廣泛存在于所有大豆品種中。研究表明，65%的大豆過敏癥狀都是由GlymBd 30K蛋白引起的，因此GlymBd 30K蛋白被視為大豆蛋白中一個重要的免疫顯性過敏原^[1-3]。早在1998年Takano就在NCBI數據庫中提交了大豆GlymBd 30K的DNA序列（AB013289），而2006年研究者^[4]在NCBI的核酸數據庫中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列（DQ324851）。目前，已有研究建立了ELISA 法、 PCR 法等方法檢測過敏原大豆成分，然而這些方法存在一些不足之處，如蛋白質耐熱性差，不適宜于現場快速檢測等缺點。

焦磷酸測序技術（Pymsequencing） 是1998年發明的一種依靠生物發光進行的實時DNA測序技術，是由4種酶催化同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，適于對已知短序列的測序分析，無需熒光標記引物或核酸探針，無需電泳，具有分析結果快速、準確、靈敏度高、經濟、自動化和實時檢測的特點^[5]。筆者首次建立大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸測序快速檢測方法，為我國進出口大豆及其制品的過敏原快速檢測提供很好的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆來源于山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心檢驗的進境大豆樣品。

綠豆、赤豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、花生等均購自當地超市。

PCR擴增引物（金斯瑞生物科技公司合成）：上游引物Bd 30KF2 5′ GCGGATGGTGTAGATTACTGGA 3′;下游引物eBd 30KR2 5′ ACCTTTAACGCGAGCAGACA 3′ ，5′端標記生物素，擴增長度188 bp。

焦磷酸測序引物（金斯瑞生物科技公司合成）：Bd 30KS2 5′ CAAAGAAACACGGGTAA 3′;測序得目標序列為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC。

2×GoTaq Master Mix PCR體系購自天根生化科技有限公司，50 bp和100 bp DNA Ladder Marker，均購自大連寶生物公司;焦磷酸測序試劑盒購自BD公司，試劑盒包括焦磷酸測序用酶、底物及各種dNTP、鏈酶親和素磁珠、綁定緩沖液、復性緩沖液、變性緩沖液、洗液。

1.2 儀器與設備

普通PCR儀（Mastercycler gradient）（德國 Eppendorf 公司）;電泳儀 （DYY6C），北京六一儀器廠;離心機（德國 Eppendorf 公司）：離心速度12000 r/min以上 ;冰箱：（4～10 ℃、-20 ℃）;微量可調移液器（德國 Eppendorf 公司）：10、100、200、1 000 μl;PyroMark ID檢測系統（瑞典Biotage公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備。樣品處理：取大豆等試驗材料100 g，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用。

DNA模板的提取采用CTAB 法^[6]：取 200 mg 樣品于 50 ml 離心管中，加入 5 ml CTAB 提取緩沖液和 20 μl 蛋白酶K 溶液，充分混勻。 65 ℃振蕩過夜后，13 000 r/min 離心 20 min，轉移上清液700 μl至新的離心管中;加入 700 μl 三氯甲烷后用力振蕩，13 000 r/min 離心 5 min， 將上清轉移到新的2 ml eppendorf離心管中;加入 2 倍體積的 CTAB 沉淀液，室溫靜置 60 min，13 000 r/min 離心 5 min，棄去上清。加入 350 μl NaCl 溶液將沉淀進行懸浮，再加入350 μl 三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 r/min 離心 10 min。轉移上清到新的2 ml eppendorf離心管中后加入 0.8 倍體積的異丙醇，室溫放置 60 min，13 000 r/min 離心 10 min，棄去上清。加入 500 μl 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μl TE 溶液中，立即使用或-20 ℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增。PCR反應體系：2×GoTaq Master Mix 25 μl，生物素標記上游引物和下游引物各10 pmol，DNA模板2 μl，加無菌去離子水至50 μl。擴增反應參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，50個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。取反應產物5 ?μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其余擴增產物用于焦磷酸測序。

1.4 焦磷酸測序 ①將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μl和Binding Buffer 47 μl，常溫混勻10 min。

②打開真空泵，將磁珠抓取臂（Vacuum Prep T001）在超純水中清洗30 s后移至96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70%乙醇中清洗5～10 s，變性緩沖液中變性5 s，洗液中清洗5～10 s。關閉真空泵，將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加人測序引物0.3 μmol/L和復性緩沖液共45 μl。

③將96孔測序板置80 ℃溫箱2 min，冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。設定程序，堿基的加入為ATCG 6～10個重復，根據程序給定劑量（該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出），在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及4種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增引物特異性檢測

利用設計引物擴增各測試材料的特異基因片段，電泳結果顯示，只有大豆樣品能夠擴增出特異性基因片段188 bp，片段長度與引物設計的預期片段長度大小一致;綠豆、赤豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、花生均無擴增條帶出現（圖1和2），說明引物能夠對大豆特異性擴增。

注：1.綠豆;2.赤豆;3.豇豆;4.蠶豆;5.50 bp ladder marker;6.大豆;7.蕓豆;8.扁豆;9.花生;10.豌豆。

圖1 PCR擴增引物特異性檢測

注：M.100 bp ladder marker。

圖2 部分實驗室大豆樣品PCR特異性擴增結果

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? 金 瑩等 焦磷酸測序技術檢測大豆過敏原成分GlymBd 30K基因

2.2 樣品焦磷酸測序結果

對13個進口大豆樣品的PCR擴增結果均進行了焦磷酸測序，測序結果（圖3）為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，具有非常好的重現性。

2.3 焦磷酸測序目標序列同源性分析 對測序結果在genbank中進行同源性比對，結果（圖4）表明目標序列與大豆過敏原GlymBd 30K基因（P34）聚為一簇，能夠作為鑒定GlymBd 30K基因很好的序列。

3 結論

該研究建立的焦磷酸測序技術吸收了PCR和DNA測序技術兩方面的優勢，在PCR特異性的基礎上，應用很短的一段保守/特異序列的測定即可滿足檢測的需要。

該研究對豆科植物和13個進境大豆樣品進行了PCR特異性擴增和焦磷酸測序研究，結果顯示，PCR擴增具有特異性，所建立大豆過敏原基因Glym Bd 30K焦磷酸測序方法能夠快速對目的基因進行測序，尚未出現假陽性和假陰性結果，具有較高的特異性。該方法具有快速、穩定性好、靈敏、特異高的特點。焦磷酸測序技術作為一種短片段測序方法，操作簡單方便，可程序化，能夠很好地保證測序結果的穩定性和準確性，另外該方法檢測速度快，40 min內即可準確、實時地測定出96個樣品目的片段的基因序列，可滿足快速檢測的需求，具有不可替代的作用。

參考文獻

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