彩葉鳳梨離體培養中外植體消毒及防止褐化的研究

史華平 王彥尊 王計平

摘要

[目的]研究彩葉鳳梨離體培養過程中外植體消毒及褐化的防止措施。 [方法]以彩葉鳳梨幼苗莖段作為外植體材料，研究其消毒和褐化防止問題。[結果]減少培養基中無機鹽濃度，外植體選用0.1%升汞溶液消毒10 min，并在MS誘導培養基中添加200 mg/L的抗壞血酸，能夠有效防止褐化，而且不影響愈傷組織的進一步分化。[結論]研究結果為彩葉鳳梨離體培養奠定基礎。

關鍵詞 彩葉鳳梨;離體培養;外植體;消毒;褐化

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-047-03

Studies on Disinfection and Antibrowning during the Tissue Culture of Neoregelia carolinae

SHI Huaping¹， WANG Yanzun²， WANG Jiping2*

（1. Pomology Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taigu， Shanxi 030815; 2.College of Agronomy， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract ?[Objective] The aim was to study disinfection and antibrowning during the tissue culture of Neoregelia carolinae.

[Method ] In this experiment， with the seedling stems of Neoregelia carolinae as explants， study on the problems in disinfection and browning of Neoregelia carolinae tissue culture was carried out. [Result]Results showed that the explant browning could be alleviated by reducing the salt concentration of medium and explants treated with 0.1% HgCl₂ for 10 min during in vitro culture. Results also showed that the medium supplemented with 200 mg/L Vc could prevent browning effectively， and did not produce bad effects on growth of Neoregelia carolinae explants.[Conclusion] The study provided basis for tissue culture of Neoregelia carolinae.

Key words ? Neoregelia carolinae; Tissue culture; Explant; Disinfection; Browning

基金項目 山西省科技攻關項目（20130311019-2）;國家自然科學基金項目（31201266）。

作者簡介 史華平（1974- ），男，山西昔陽人，助理研究員，從事植物組織培養技術研究。*通訊作者，副教授，博士，從事植物生理與分子生物學研究。

收稿日期 20141205

彩葉鳳梨（Neoregelia carolinae）又名赪鳳梨、五彩鳳梨，為鳳梨科彩葉鳳梨屬植物。原產于巴西，無明顯休眠期，喜溫暖、濕潤和陽光充足的環境，不耐寒，怕干燥和強光暴曬^[1]。我國彩葉鳳梨的栽培時間不長，從20世紀80年代開始進入引種階段，至今僅有小批量的生產，主要集中在廣東、海南、福建和云南昆明等地。

彩葉鳳梨通常以分株、播種繁殖為主，時間限制十分明顯，而且生長緩慢，繁殖率低，且苗不整齊，通過植物組織培養技術可以大大提高其繁殖率^[1-2]，短期內獲得大量整齊一致的種苗，因此通過組織培養快速繁殖鳳梨是一條很理想的途徑。然而，在離體培養過程中，首先遇到的是外植體嚴重褐化而導致培養物死亡的問題，筆者針對該問題，對彩葉鳳梨離體培養過程中外植體消毒及褐化的防止措施進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西農業大學農學院組培試驗室提供的彩葉鳳梨為材料，取其幼苗莖段作為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理與消毒。

1.2.1.1 材料預處理。

取彩葉鳳梨幼苗，流水沖洗干凈，切下其莖段，在無菌條件下用75%乙醇表面消毒30 s，用消毒劑消毒，最后無菌水清洗6～8次，用無菌濾紙吸干材料表面水分后備用。

1.2.1.2 表面消毒劑的篩選。分別用2%、5%NaClO及01%、0.2%的HgCl₂溶液按如下設置進行外植體消毒。①2%的NaClO消毒10 min;②2%的NaClO消毒20 min;③2%NaClO消毒30 min;④5%的NaClO消毒10 min;⑤5%NaClO消毒20 min;⑥5%NaClO消毒30 min;⑦0.1%HgCl₂溶液消毒5 min ;⑧0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑨0.2%HgCl₂溶液消毒5 min;⑩0.2%HgCl₂溶液消毒10 min。每處理20個外植體，重復3次。

1.2.1.3 外植體處理時間的確定。

用0.1%HgCl₂溶液按以下時間設置對莖段外植體進行消毒處理。①0.1%HgCl₂溶液消毒3 min;②0.1%HgCl₂溶液消毒5 min;③0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;④0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;⑤0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。消毒的外植體接種于無菌培養基上。培養基配方為MS+6BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加0.6%瓊脂和3%蔗糖，pH 5.6～5.8。每處理20個外植體，重復3次。培養20 d后，統計外植體污染率，死亡率，存活率。

1.2.2 外植體褐化的防止。研究不同基本培養基及消毒劑的種類和處理方法對外植體褐化的影響，每個處理接種20個，設3次重復。

1.2.2.1 不同消毒劑處理對外植體褐化的影響。

取彩葉鳳梨的幼苗莖段，流水洗凈后設6個處理：①在無菌條件下用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;②用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒10 min;③用75%乙醇表面消毒30 s后，于0.1%HgCl₂溶液消毒15 min;④直接用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min;⑤直接用01%HgCl₂溶液消毒10 min;⑥直接用0.1%HgCl₂溶液消毒15 min。

1.2.2.2 不同基本培養基對外植體褐化的影響。

將基本培養基設為MS、1/2MS、N6和B5 4種類型，分別附加6BA 3.0 mg/L及NAA 0.1 mg/L，分析不同培養基類型對彩葉鳳梨外植體褐化的影響。

1.2.2.3 不同濃度抗壞血酸處理對外植體褐化的影響。在培養基中添加不同濃度抗壞血酸（Vc），以沒有任何防褐化處理的外植體作為對照，篩選抗壞血酸防止外植體褐化的最適濃度。

2 結果與分析

2.1 外植體材料的處理

2.1.1 消毒劑對外植體消毒效果的影響。

從表1可以看出，2% NaClO處理10 min的污染率達到62.1%，存活率為34.4%，而5% NaClO處理20和30 min的存活率達到68%左右;01%和0.2% HgCl₂消毒5和10 min的存活率均保持在70%以上;表明2種滅菌劑對彩葉鳳梨幼苗莖段外植體消毒效果之間存在顯著差異，不同濃度HgCl₂消毒效果均優于NaClO，污染率降低，存活率提高。對存活率分析表明，處理⑧是彩葉鳳梨莖段外植體較適宜的消毒方法，即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植體存活率高達92.6%。

表1 消毒劑對莖段消毒效果的影響

%

處理污染率死亡率存活率

①62.1 3.534.4

②45.22.652.2

③36.0 3.061.0

④58.2 4.337.5

⑤23.5 8.468.1

⑥17.6 14.867.6

⑦14.2 11.874.0

⑧2.05.492.6

⑨8.3 5.286.5

⑩1.8 18.479.8

2.1.2 處理時間對外植體消毒效果的影響。

為了進一步確定0.1%HgCl₂對外植體材料的最佳處理時間，分別設置了5個處理時間進行消毒，結果見表2。由表2可知，隨著處理時間的延長，外植體污染率逐漸降低，死亡率升高，說明較長時間HgCl₂處理會對外植體材料造成一定傷害。5個不同處理時間中，0.1%HgCl₂處理3 min外植體的死亡率雖然是0，但外植體的污染率卻達到64.5%，存活率也只有35.5%;而用0.1%HgCl₂處理7～15 min，雖然外植體有一定的污染，但死亡率較低，其存活率在80%左右，結果表明，處理④即0.1% HgCl₂消毒10 min，外植體存活率高達92.6%，消毒效果最好，是較適宜的外植體處理時間。

表2 處理時間對外植體材料消毒效果的影響

%

處理污染率死亡率存活率

①64.5035.5

②14.211.874.0

③8.5 10.381.2

④2.05.492.6

⑤2.318.179.6

2.2 外植體褐化的防止

2.2.1 不同表面消毒方式對外植體褐化的影響。由表3可知，用75%乙醇處理外植體材料，明顯加劇了褐化程度，處理后1 d即出現中度褐化;0.1%HgCl₂溶液消毒10或15 min，褐化現象也較明顯，而用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植體褐化程度較輕，表明用0.1%HgCl₂溶液消毒處理對褐化的影響較小。

表3 不同表面消毒方式對外植體褐化的影響

處理處理時間∥d

1234

①+++++++++++

②+++++++++++

③++++++++++++

④++++++++

⑤+++++++++

⑥+++++++++++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴重褐化。

2.2.2 不同基本培養基對外植體褐化的影響。

過高無機鹽濃度會引起某些植物外植體中酚類物質氧化，引起褐變;培養基的狀態及硬度也會影響外植體褐化程度。以MS培養基作為對照，分別附加相同激素成分，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH 5.6～5.8。

表4 基本培養基對外植體褐化的影響

培養基處理時間∥d

1234

MS++++++++

1/2MS+++++++

N6+++++++

B5+++++++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴重褐化。

由表4可知，MS培養基比其他培養基褐化速度更快，而其他3種培養基之間則無明顯差異。

2.2.3 不同濃度抗壞血酸對外植體褐化的影響。

在MS培養基中添加50、100、200和300 mg/L抗壞血酸，對外植體褐化有一定的抑制效果（表5），其中，較低濃度抗壞血酸在培養初期有防褐作用（50 mg/L在6d前，100 mg/L在8d前），200和300 mg/L抗壞血酸能夠很好地防止彩葉鳳梨外植體褐化的產生。

防褐化劑對愈傷組織和不定芽的產生有不同的影響，所以在添加抗壞血酸的培養基中培養莖段20 d時，對不定芽和愈傷組織的產生進行了記錄，發現都有不定芽的產生，葉片也有愈傷組織的產生，因此認為，在培養基中添加200 mg/L的抗壞血酸能夠較好地防止褐化，且不影響分化。

表5 不同濃度抗壞血酸對外植體褐化的影響

抗壞血酸濃度

mg/L處理時間∥d

4681020

對照++++++++++++++

50+++++++++++++

100+++++++++++

200NNN++

300NNN++

注：N.沒有褐化，+.輕度褐化，++.中度褐化，+++.嚴重褐化。

3 結論與討論

3.1 外植體的選擇及滅菌

外植體是植物組織培養的材料，其表面和內部常攜帶一些微生物，是組織培養過程的主要污染源，外植體的消毒是植物組織培養能否成功的第一步，在培養時常因消毒效果不佳而導致失敗。外植體表面消毒的關鍵是選擇合適的消毒劑和消毒時間。因為消毒劑不僅能殺死微生物，也會對外植體產生一定的傷害。不同植物或同一植物不同外植體消毒方法不同，為達到滿意的滅菌效果，需要根據外植體的情況，選擇合適的消毒劑，摸索出合理的消毒時間，焦立為等^[3]用臭氧對橡皮樹帶有頂芽的葉片進行消毒，結果表明，臭氧用于外植體消毒滅菌的效果很好，接種20 d后，污染率為0%，且頂芽（有鱗葉包被）接種后的成活率極高;Abdul Qayyum Rao 等^[4]采用0.1%HgCl₂對棉花種子表面消毒時，種子在消毒液中浸泡20 ?min，遠遠超出一般時間范圍，但仍不會對種子造成傷害。在使用消毒劑時，有時只用1種消毒劑對外植體進行消毒，有時是將2種或幾種消毒液混合后對外植體進行消毒，劉香玲等^[5]使用混合消毒劑對水稻種子進行滅菌，將水稻種子去殼后，先用70%乙醇消毒1 min，再用0.1%HgCl₂和2% NaClO（1∶1）的混合消毒液浸泡20 min。該研究對彩葉鳳梨幼苗莖段采用0.1%HgCl₂消毒10 min，其存活率可達92.6%。

3.2 外植體褐化及防止

外植體褐化是鳳梨科植物等許多植物離體培養過程中的常見問題，發生褐化現象會直接導致培養物死亡，嚴重阻礙了快繁過程。影響褐化的因素很多，也很復雜，植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態、外植體消毒情況、培養方式等的不同，褐化程度也有所不同。首先，接種時各種化學消毒劑對外植體的傷害會引起褐化。消毒劑不同，消毒時間不同，外植體褐化程度也不同。乙醇消毒雖然效果較好，但易對材料造成傷害，導致褐化，HgCl₂對外植體傷害較輕，且消毒時間越長，效果越好，但褐變越嚴重^[6]。在消毒時間方面，一般是消毒時間越長，褐化率越高^[7]，因而消毒時間應掌握在一定范圍內才能保證較高的外植體成活率。該研究用0.1%HgCl₂溶液消毒7 min，外植體褐化程度較輕，而75%乙醇處理外植體材料，明顯加劇了褐化程度。

其次，培養基狀態及過高的無機鹽濃度也會引起外植體褐變，如把核桃分別在固體、半固體和液體培養基上培養，半固體培養基芽的誘導獲得成功，而其他培養基上都發生了褐變^[8]。在金錢樹愈傷組織誘導過程中，采用液體培養對防止褐化有很好的作用^[9]。在桑樹組培中，降低無機鹽濃度，將MS培養基改為1/2MS培養基能減輕褐變，降低褐化率^[10]。劉蘭英^[11]在核桃組培中發現，將DKW培養基的無機鹽濃度減少一半，核桃外植體褐變率由55.8%降至32.5%。該研究結果表明MS培養基比1/2MS、N6及B5培養基褐化速度更快。

另外，在培養基中加入防褐化劑可以明顯減少褐變發生。防褐化劑一般分為2種：一種是吸收醌類物質的吸附劑，如活性炭，它是一種吸附性較強的吸附劑，但其吸附作用沒有選擇性，在吸附酚類氧化物的同時也吸附營養物質，研究表明，活性炭能有效控制褐化和促進生長，但不利于分化^[12];另一種是防止酚氧化的抗氧化劑，如Na₂SO₃和NaHSO₃，主要是影響酚類化合物與酶結合來有效防止褐化，抗壞血酸（Vc）也屬于抗氧化劑，是一種酚氧化酶抑制物，它可以將該酶的Cu²⁺還原成Cu+^[13]。雖然Na₂SO₃的防褐化作用最佳，但不利于不定芽和愈傷組織的發生，影響外植體培養。彭筱娜等^[14]研究表明，在培養基中添加200 mg/L抗壞血酸可以有效防止觀賞鳳梨褐化的產生。該試驗同樣采用200 mg/ L的抗壞血酸作為一種有益的防褐化添加物，也可以有效防止彩葉鳳梨莖段外植體褐化，促進外植體的培養。

參考文獻

[1]

林云甲.彩葉鳳梨的觀賞與栽培[J].花木盆景（花卉園藝），2001（7）：19.

[2] 徐立，李志英，賴齊賢，等.彩葉鳳梨的組織培養及快速繁殖[J].植物生理學通訊，2003，39（4）：344.

[3] 焦立為，黃克梅，閆小飛，等.植物組織培養前用臭氧對外植體進行消毒滅菌的效果初探[J].植物生理學通訊，2002，38（5）：466.

[4] ?ABDUL QAYYUM RAO，S SARFRAZ HUSSAIN，M SAQIB SHAHZ A D， et al. Somatic embryogenesis in wild relatives o f cotton （Gossypium Spp.）[J]. Journal of Zhejiang University Science B， 2006，7（4）：291-298.

[5] 劉香玲，王玉珍，羅景蘭.水稻成熟胚愈傷組織的誘導和分化因素的研究[J].山東農業科學，2005（5）：7-9.

[6] ?胡彥，趙艷.植物組織培養技術的應用以及在培養過程中存在的問題[J].陜西師范大學學報：自然科學版， 2004， 32（S1）：130-134.

[7] ?繆耀梅，李開彪，葉添謀.組織培養過程中污染和褐化的防治[J].韶關學院學報，2003，24（6）：101-103.

[8] ?吳曉霞，陳剛，張彪，等.植物組織培養中褐變的研究進展[J].河北林果研究，2002，17（3）：284.

[9] ?唐利球，唐君海，陸祖正，等.金錢樹愈傷組織的誘導及其褐化的防止[J].廣西熱帶農業，2005，（3）：12-13.

[10] 邱璐，陳善娜，夏躍明，等.桑樹組織培養中的褐化問題的研究[J].云南大學學報，2000， 22（1）：76-78

[11] 劉蘭英.‘薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究[J].園藝學報，2002， 29（2）：171-172.

[12] 劉真華，葛紅，郭紹霞，等.蝴蝶蘭組織培養中的褐化控制研究[J].園藝學報，2005，32（4）：732-734.

[13] 丁連忠.抗壞血酸衍生物抑制蘑菇的多酚氧化酶[J].食品科學，1991，67（2）：22-25.

[14] 彭筱娜，易自力，蔣建雄，等.觀賞鳳梨組織培養中防止外植體褐化的初步研究[J].湖南農業科學，2007（4）：67-69.