淺談基因工程中獲取目的基因的幾種方法

【摘 要】依據(jù)基因工程的實際特點，分別對獲得目的DNA的反向PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR和錨定PCR等幾個常用的基因克隆方法進行了對應(yīng)的介紹和分析。

【關(guān)鍵詞】反向PCR;反轉(zhuǎn)錄PCR;錨定PCR;基因克隆;方法

據(jù)實踐可知，實施基因工程的程序，首先是要取得目的DNA的片段，這是前期必要的步驟。因此，怎么去圓滿地完成這一過程，就成為了基因工程中的首要因素。單從目的DNA的提供方式而言，其只有分離天然動植物DNA及人造DNA兩種方式。而就獲得目的基因的方法而言，其基本上有PCR、化學合成、cDNA和設(shè)置基因文庫的方式進行優(yōu)選等幾種類型。

1.何謂基因工程的PCR

在一九八五年，美國相關(guān)公司的數(shù)名專家首先設(shè)置了快速復(fù)制增加特性DNA片段的工藝技術(shù)，具體的化學名稱叫做聚合酶鏈式反應(yīng)，其英文縮寫即為PCR。基因聚合酶起初是在一九五五年被發(fā)現(xiàn)的，而富含較高實用價值的聚合酶是在七十年代初期才被發(fā)現(xiàn)的。然而，因為此聚合酶不具有耐高溫性能，其在高溫的情況下就會發(fā)生較大的性能改變，所以，不適合高溫的聚合酶鏈式反應(yīng)。現(xiàn)時被廣為使用的一種聚合酶，是在一九七六年取自于溫泉水里的一種細菌。它是具有相當耐高溫性能且極為完好的一種酶。初始的PCR概念基本是指基因的修復(fù)和復(fù)制，它具有單一和短暫的性能缺陷。從一九八三年開始，PE公司就率先應(yīng)用了新的PCR。

因為PCR屬于一類體外快速增加指定DNA或其序列的功能系統(tǒng)，所以還可以取名為DNA的體外擴增法。在當今PCR工藝已經(jīng)是人類獲取外部基因的一個最佳手段，只要掌握了目的DNA的核苷酸排序，人們即能夠擬定出一段引物，采取PCR工藝，在試管內(nèi)設(shè)置反應(yīng)過程，經(jīng)歷若干小時以后，即可以把相當小量的目的DNA或指定的基因片段增加數(shù)十萬倍。甚至達到百萬倍。

2.PCR工藝過程機理

由于PCR工藝是一項體外復(fù)制特定基因片段的生物技術(shù)，所以，其與基因分子的體內(nèi)復(fù)制過程有若干相似的情況，同時也存在著不少的相異地方。細胞里基因的復(fù)制過程是首先把雙鏈DNA分解螺旋變成單鏈DNA。爾后，RNA引物與單鏈DNA模板結(jié)好對，在有四種核苷酸底物的前提下，基因聚合酶與RNA引物的3端依據(jù)堿基互補配對的規(guī)則組合成具有互補性的基因鏈。經(jīng)過一個復(fù)制過程后，單個基因分子變成了雙個基因分子。PCR就是代表試管里進行的基因復(fù)制經(jīng)歷，其余體內(nèi)基因復(fù)制模式相同，都要具備單鏈模板、引物、四種核苷酸底物、基因聚合酶，復(fù)制后達到相同的效果。其區(qū)別就是PCR所使用的引物是單鏈的基因引物，其聚合酶是屬于耐高溫性能的。在試管中所作的整個復(fù)制過程分三個過程：第一步是變性過程，其為PCR反應(yīng)的第一階段，也就是把模板基因放置在九十五攝氏度左右的高溫之中，將雙鏈基因轉(zhuǎn)變成單鏈基因;第二步即為退火過程，也就是把反應(yīng)溫度下調(diào)到五十攝氏度左右，促使一隊引物先后與變性后的兩個模板實施配對;第三步為延伸過程，即把反應(yīng)溫度設(shè)置在聚合酶反應(yīng)的最佳溫度七十二攝氏度，爾后，用目的基因做模板合成新的基因鏈。因為其所用聚合酶的耐高溫品質(zhì)，在每個復(fù)制階段完成后，無需增加任一別的反應(yīng)組分即能夠重新開始下一階段的復(fù)制。

3.PCR方法的基因復(fù)制

采用PCR復(fù)制DNA片段系基因工程的一項重要手段。

3.1依托反向PCR復(fù)制目的基因片段

由基因組依托PCR復(fù)制基因片段過程的重要一環(huán)是引物的擬定，通常能夠依據(jù)業(yè)已公布的基因排列擬定引物，也可以憑借原有的相關(guān)基因序列擬定引物。若要依據(jù)cDNA排列擬定引物增加基因數(shù)目，擬定引物時，必須顧及到cDNA基因沒有內(nèi)含子，而gDNA存在內(nèi)含子，擬定引物時，不能夠置于外顯子的拼接點上。擬定引物時，一般可以在引物的末端設(shè)置一個酶切位點，從而促進基因片段與載體的連接。

反向PCR系一類依托原有系列增加其旁側(cè)序列的模式，憑借此方法，能夠?qū)嵤┤旧w步移。其開始的步驟，是把基因組DNA依靠限制性的內(nèi)切酶給予切割開來，莎草用的限制酶必須在原有序列中不存在切點，而后再依托連接酶把酶切片段連接起來，與此類產(chǎn)物中，其含有原來序列的環(huán)形基因會得到大幅度增加。由此獲取原來基因片段的旁側(cè)序列。

3.2 cDNA的制備及cDNA文庫的建立

cDNA的制備可以采用RT-PCR方法。亦被稱作反轉(zhuǎn)錄PCR。其屬于一類酶促進制備方法，就是用mDNA做模板，依靠反轉(zhuǎn)錄酶的作用，用四種脫氧核甘三磷酸為反應(yīng)物成分制備DNA，再通過復(fù)制以后就可得到雙鏈的基因。

3.3錨定PCR過程及基因的復(fù)制

經(jīng)過RT-PCR過程獲取的大規(guī)模雙鏈cDNA以后，欲要精選分離出所需的特定目的基因，若不用cDNA文庫篩選時，尚可運用錨定PCR的方法將其收獲。此種措施的特點，是憑借原已存在的一中特異性的引物來實現(xiàn)，其尤其適合于擴增那些緊掌握一段序列形態(tài)的目的基因，比如一端序列已經(jīng)知道，而另一段序列未知的基因片段，能夠依托基因末端轉(zhuǎn)移酶將cDNA第一個末端添上一端多聚dG尾巴，爾后添加一個末端屬于多聚dC的特異引物，由此決定了擴增的特性。錨定PCR是研究遺傳學及醫(yī)學的有效方法。

小結(jié)

通過上述介紹和分析，我們基本掌握了獲取目的基因的來源和幾種相當實用的基因克隆方法，這幾種很常用的方法，它們都有各自的特性和優(yōu)點，我們在實際基因工程研究中，還要不斷的總結(jié)、完善并加以創(chuàng)新，促使其能夠更好地為我們?nèi)祟惖倪z傳、醫(yī)學等相關(guān)行業(yè)服務(wù)。

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【作者簡介】

于麗麗（1981.12-），籍貫：吉林省梨樹縣;單位：公主嶺實驗中學。

（作者單位：公主嶺實驗中學）