甘蔗脫毒健康種苗中單糖轉運蛋白基因差異表達分析

王俊剛 趙婷婷 楊本鵬 蔡文偉 張樹珍

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

甘蔗脫毒健康種苗中單糖轉運蛋白基因差異表達分析

王俊剛 趙婷婷 楊本鵬 蔡文偉 張樹珍

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

旨在探討脫毒處理對單糖轉運蛋白表達量的影響，分析了3種甘蔗單糖轉運蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a在健康種苗和常規種苗不同生長時期的表達量差異。結果顯示，在苗期和分蘗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a表達量高于未脫毒種苗；在拔節期和成熟期甘蔗脫毒健康種苗未成熟莖節中SGT1、SGT2和PST2a表達量也高于未脫毒種苗；而在成熟莖節中表達量沒有差異。苗期和分蘗期甘蔗葉片以及未成熟莖節中細胞生長分裂旺盛，需要利用大量單糖以提供能源和生物合成的前體物質。結果表明，該3種單糖轉運蛋白基因表達量上升可能提供更多單糖用于細胞代謝，促進脫毒健康種苗的快速生長及最終生物量的積累。

甘蔗；健康種苗；單糖轉運蛋白基因；基因表達；產量

高等植物中源庫組織相互交織形成一個復雜的有機整體。一些源組織如成熟葉片主要為糖類等有機物合成的場所，其合成的光合產物主要以蔗糖的形式運輸至庫器官后，一部分儲存在薄壁細胞中，另外一部分在各種蔗糖代謝酶的作用下水解為單糖，并在單糖轉運蛋白的協助下被庫器官所利用，從而為植物的生長提供基本能量和營養物質。植物單糖轉運蛋白屬于易化因子超家族（Major facilitator superfamily）成員之一，是一種能量依賴性H+共轉運蛋白，具有12次跨膜結構，包括己糖轉運蛋白（hexose transporter，HT）和葡萄糖轉運蛋白（glueose tansporter，GT）等，在植物碳水化合物分配、韌皮部裝載和卸載、植物防御以及糖信號過程中發揮關鍵作用，同時與植物生物量形成有密切的關系［1-3］。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是最為重要的糖料作物，是一種多年宿根無性繁殖栽培作物。多年種植尤其是宿根后，幾乎所有甘蔗品種在大規模應用后均受到宿根矮化病（Ratoon Stunting Disease，RSD）和甘蔗花葉病（Sugarcane mosaic virus，SCMV）的危害，導致品種退化，造成甘蔗減產達10%，有的甚至高達50%［4，5］。目前，生產上尚無有效的化學方法防治這兩種病害。研究表明，采用熱處理結合腋芽分生組織培養技術培育的脫毒健康種苗是防治這兩種病害最有效的措施之一［6-10］。種植甘蔗脫毒健康種苗可以增產20%-40%［6-8］。從甘蔗農藝性狀上對其增產機理研究比較多［8，9］，但更進一步分子水平的增產機理還未見報道。本研究利用已報道的3個甘蔗單糖轉運蛋白基因PST2a（Putative Sugar Transporter 2a，PST2a）、SGT1（Glucose Tansporter1，SGT1）和SGT2（Glucose Tansporter2，SGT2）為研究對象，分別從甘蔗生長的苗期、分蘗期、拔節期和成熟期對它們的表達量進行比較分析，以期探討脫毒處理對單糖轉運蛋白表達量的影響，從分子生物學層面上揭示種植脫毒健康種苗可能的增產機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為ROC22脫毒健康種苗二代種莖苗和未脫毒ROC22種莖。材料來源于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所甘蔗試驗地。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取、定量及完整性檢測 取從10個完整植株剝離的凍存樣品進行研磨，用RNAout試劑盒（北京天澤基因）試劑提取全部研磨樣品的總RNA以減少取樣誤差。用核酸分析儀（Eppendorf Biophotometer Plus）測260 nm和280 nm處的吸光值，以A260/A280比值估計總RNA的純度，以A260的值進行總RNA定量。以1.2%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 第一鏈 cDNA的合成 取甘蔗總RNA 3 μg與反轉錄引物（oligo-dT接頭引物）1 μL（10 pmol/L）混合，70℃加熱5 min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5 mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉錄酶，反應體系為25 μL。反應過程為42℃ 60 min，70℃ 15 min，5 min后瞬時離心，最后放入-80℃保存備用。

1.2.3 引物設計 根據公布的甘蔗單糖轉運蛋白基因SGT1（GenBank 登錄號：L21752）、SGT2（GenBank登錄號：L21753）、PST2a（GenBank登錄號：AY-165599）序列利用primer3設計引物，內參GADPH基因引物引自參考文獻［11］。

表1 引物序列、PCR擴增基因片段長度和擴增效率

1.2.4 Real-Time PCR 擴增及數據分析 選用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）試劑盒，按照說明書建立25 μL熒光定量PCR 反應體系：cDNA模板1μL，引物1、引物2各1 μL，RoxⅡ 0.5 μL，SYBR Taq 12.5 μL，dH2O 9 μL；反應程序：95℃熱變性15 s；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40個循環。反應在Mx3005P（Stratagene）上完成，每個處理設置3 次重復，擴增效率見表1。以甘蔗GADPH基因為內參基因，所有結果以2-ΔΔCT法計算相對定量值［12］。

2 結果

2.1 RNA 純度鑒定

不同組織以及不同生長時期的總RNA瓊脂糖凝膠電泳表明，28S和18S條帶清晰可見，無明顯降解；A260/A280比值皆在1.8-2.2之間，可用于下一步試驗。

2.2 苗期單糖轉運蛋白基因表達分析

研究結果表明，3個單糖轉運蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a在苗期甘蔗葉片中均有表達；在脫毒健康種苗未成熟葉片中表達量均明顯高于未脫毒種苗；在脫毒健康種苗成熟葉片中SGT1和SGT2表達量與對照無差異，PST2a基因表達量升高（圖1）。

圖1 甘蔗苗期不同組織SGT1、SGT2和PST2a基因相對表達量

2.3 分蘗期單糖轉運蛋白基因表達分析

選擇甘蔗分蘗中期單糖轉運蛋白基因的表達特征進行分析。大約在甘蔗第一棵分蘗苗長出7 d后，對主莖甘蔗進行采樣，此時主莖甘蔗葉片光合效率高，需要大量合成有機化合物，隨后光合效率維持一段時間后，慢慢降低（數據未顯示）。研究結果（圖2）表明，SGT1、SGT2和PST2a在脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中的表達量較未脫毒種苗均大幅提高，表明脫毒處理可能使分蘗期甘蔗葉片中單糖利用效率提高，促進植株的分蘗和快速生長。

圖2 甘蔗分蘗期不同組織SGT1、SGT2和PST2a基因相對表達量

2.4 拔節期單糖轉運蛋白基因表達分析

甘蔗拔節期為莖稈快速生長時期，甘蔗最終生物量與此階段的快速生長呈正相關。結果（圖3）表明，SGT1、SGT2和PST2a在拔節期甘蔗脫毒健康種苗葉片中表達量與未脫毒種苗差異不明顯；然而在莖節中的表達量差異卻呈現出一定的趨勢：在幼嫩未成熟1-3莖節中，表達量稍有提高；隨著莖節發育糖分的快速利用，到7-8節SGT1、SGT2和PST2a表達量均大幅提高；隨著莖節成熟表達量差異增幅逐漸變小或沒有差異，可能與甘蔗莖稈中單糖的利用效率呈正相關。

圖3 甘蔗拔節期不同組織SGT1（A）、SGT2（B）和PST2a（C）基因相對表達量

圖4 甘蔗成熟期不同組織SGT1（A）、SGT2（B）和PST2a（C）基因相對表達量

2.5 成熟期單糖轉運蛋白基因表達分析

結果（圖4）表明，SGT1和PST2a在成熟期脫毒健康甘蔗種苗葉片中的表達量大幅增加，而SGT2表達量差異較小；SGT1和SGT2在脫毒健康種苗未成熟莖節中表達量大幅提高，隨著莖節成熟表達量低于對照，然而PST2a在成熟期脫毒健康甘蔗種苗莖稈中的表達量與未脫毒種苗沒有差異。表明該3種單糖轉運蛋白可能在不同組織中參與調控單糖的分配及利用。

3 討論

植物單糖轉運蛋白是調控生物量的一類重要蛋白［13］。在多種植物中均存在多基因現象，并且在不同植物中基因成員數及不同部位表達量也有所不同。在植物生長發育過程中不同單糖轉運蛋白可能是通過協同作用實現其生理學功能［14-16］。水稻單糖轉運蛋白OsMST6在種子灌漿中期表達量達到最高，隨著種子成熟逐漸降低，主要表達部位在幼嫩種子維管薄壁組織的珠心和胚乳、花粉、花藥以及葉片葉肉細胞中，推測OsMST6可能與種子形成及產量有相關性［17］；水稻OsMST4 在種子灌漿期早期和中期表達量最高，隨后降低，擬推測其重要功能為種子形成供應單糖［18］；擬南芥單糖轉運蛋白STP1和STP13在根部表達，能夠從根的周圍吸收糖分［19］；通過提高擬南芥單糖轉運蛋白TMT1表達量能夠增加其種子的生物量［13］。各種單糖轉運蛋白差異表達量和組織特異性表達，也決定了其在植物不同發育階段發揮不同的作用。此外，單糖轉運蛋白也參與植物防御過程，通常基因表達受到病原菌入侵的調控［3］。

種植甘蔗脫毒健康種苗通常能夠增產20%以上，其增產機理在田間主要表現為分蘗強、生長快、成莖率高等性狀［8］。然而進一步從分子生物學方面對其可能的增產機理的研究報道較少，特別是關于單糖轉運方面的研究還未見報道。植物中單糖轉運蛋白通常與單糖的快速利用和分配相關。在生長和細胞分裂旺盛的細胞及組織中通常對單糖的需求高，因此也需要較多的單糖轉運蛋白參與。本研究表明，甘蔗SGT1、SGT2和PST2a基因在脫毒健康種苗苗期和分蘗期葉片中的表達顯著高于未脫毒種苗，表明脫毒處理可能使得這一生長階段甘蔗葉片中單糖利用提高，促進葉片及整株植株的快速生長發育，這也可能為脫毒健康種苗的強分蘗提供更多的單糖而被加以利用。SGT1、SGT2和PST2a在拔節期脫毒健康種苗快速生長1-8莖節中的表達明顯高于對照，可能有利于莖節的快速生長，為其提供更多的單糖以及纖維素合成前體底物，因此進一步需要更多的單糖轉運蛋白來增強對單糖的利用。SGT1和SGT2在脫毒健康種苗成熟期1-8節莖節中大量表達，有利于未成熟莖節增粗，增加產量；同時在成熟莖節中表達量降低，降低了對單糖的利用，促進蔗糖的積累，提升甘蔗品質。通過對整個生長期脫毒健康種苗和非脫毒苗中的單糖轉運蛋白基因差異表達研究表明：單糖轉運蛋白基因表達量與甘蔗脫毒健康種苗的產量形成呈正相關；該3種單糖轉運蛋白基因表達可能受到甘蔗病害的抑制，進一步預測它們可能有利于甘蔗的產量形成。

4 結論

本研究采用Real-Time PCR技術分析了甘蔗脫毒健康種苗和常規種苗中3種單糖轉運蛋白基因SGT1、SGT2和PST2a不同生長時期的表達量差異。研究結果表明：（1）在苗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中PST2a基因表達高于未脫毒種苗；SGT1和SGT2基因在未成熟葉片中表達高于未脫毒種苗。（2）在分蘗期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a表達量均明顯高于對照。（3）在拔節期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1、SGT2和PST2a基因表達與對照沒有差異；而在未成熟莖節中SGT1、SGT2和PST2a基因表達量都明顯高于對照，隨著莖節成熟表達量差異逐漸縮小。（4）在成熟期甘蔗脫毒健康種苗葉片中SGT1和PST2a基因表達量比對照高；未成熟莖節中SGT1和SGT2基因表達量高于對照，而成熟莖節中表達量沒有差異。

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（責任編輯 馬鑫）

The Differential Expression of Monosaccharide Transporter Genes in Disease-free Sugarcane Plants

Wang Jungang Zhao Tingting Yang Benpeng Cai Wenwei Zhang Shuzhen
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101）

The sugarcane yield can be increased by planting disease-free sugarcane seedlings. However， the physiological and molecular mechanisms of this yield increasing are still not clear now. Monosaccharide transporters are one type of key regulatory proteins involved in carbon accumulation and partitioning processes， and play an important role in plants defense process. The differential expression of three monosaccharide transporter genes（SGT1， SGT2 and PST2a）in disease-free and untreated sugarcane plants was studied to clarify the potential function of these genes on sugarcane yields. The expression levels of SGT1， SGT2 and PST2a in leaves of disease-free plants at seedling and tillering stages were obviously higher than untreated plants. Furthermore， the expression levels of these genes were increased in immature internodes of disease-free plants at elongation and mature stages， but there were no difference in mature internodes. The sugarcane leaves（at seedling and tillering stages）and the immature internodes（at elongation and mature stages）grow rapidly and demand for more monosaccharide to provide energy and the precursor of biosynthesis. The up-regulations of these monosaccharide transporter genes might accelerate the growth and biomass accumulation of disease-free sugarcane plants by increasing the transporting and uptake of monosaccharide.

sugarcane；disease-free plants；monosaccharide transporter gene；gene expression；yield

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.016

2014-09-04

“863”計劃（2013AA102604-1），海南省自然科學基金項目（313078），海南省重大科技項（ZDZX2013023-1）

王俊剛，男，博士研究生，助理研究員，研究方向：甘蔗生物技術；E-mail：wangjungang@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術；E-mail：zhangsz2007@163.com