河北區試小麥品種（系）DNA指紋圖譜構建及遺傳差異分析

李宏博龐斌雙劉麗華劉陽娜趙昌平陳景堂

（1. 河北農業大學農學院，保定 071001；2. 北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心 雜交小麥分子遺傳北京市重點實驗室，北京 100097）

河北區試小麥品種（系）DNA指紋圖譜構建及遺傳差異分析

李宏博1，2龐斌雙2劉麗華2劉陽娜2趙昌平2陳景堂1

（1. 河北農業大學農學院，保定 071001；2. 北京市農林科學院雜交小麥工程技術研究中心 雜交小麥分子遺傳北京市重點實驗室，北京 100097）

采用42個 SSR 標記為 2009-2013年河北省區域試驗的70份小麥品種（系）構建DNA指紋圖譜，進行遺傳差異分析，為小麥品種改良和種質資源創新提供參考。結果表明，42個SSR 標記在70份品種（系）中共檢測到303個等位變異，單個SSR位點的平均等位變異為7.21個，PIC值平均0.69；基因多樣性平均0.73，遺傳相似系數變化范圍為0.05-1.00，平均0.28；表明參加河北省區域試驗的品種（系）間存在不同程度的遺傳差異。聚類分析把70份品種（系）劃分為4大類，6個亞類，表明同一育種單位或地區品種（系）遺傳背景相近，應該加大外來小麥種質資源的引進和利用力度。

小麥；SSR標記；DNA指紋圖譜；遺傳差異

小麥是世界上主要糧食作物之一，也是我國繼玉米和水稻之后的第三大糧食作物。小麥區域試驗是篩選優良品種、促進農業生產持續高產穩產的舉措，同時也是防止品種混雜退化、提高種子質量的重要手段［1］。我國《主要農作物品種審定辦法》規定（農業部令2013年第4號），參加國家或省級區域試驗的農作物品種必須具備特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩定性（Stability）。多年來隨著育成品種遺傳背景日漸趨同化，派生品種日益增多。因此，對參試小麥品種的遺傳背景進行實時監控，對于維護我國小麥種業健康持續穩定發展，保障我國小麥糧食安全意義重大。

SSR分子標記由于數量豐富、多態性高、覆蓋全基因組、呈共顯性、技術簡單等優點［2-4］，被廣泛應用在作物的DNA指紋圖譜構建和遺傳多樣性研究。關于作物的DNA圖譜研究，我國已經構建了玉米［5］、水稻［6］、棉花［7］等主要農作物品種的DNA指紋圖譜，在構建小麥品種DNA指紋圖譜方面也開展了相關研究工作［8-10］。而將SSR標記用于小麥親緣關系、遺傳差異分析和遺傳多樣性等研究，前人做了大量工作。郝晨陽等［11］對我國近50年育成小麥品種的遺傳多樣性演變規律進行分析，詹克慧等［12］對黃淮麥區的部分小麥種質資源進行了遺傳差異研究。蒲艷艷等［13］、耿惠敏等［14］利用SSR標記分別對山東省、河南省小麥品種進行遺傳多樣性分析。本研究在前期研究的基礎上，采用42個SSR標記，對70份2009-2013年參加河北省區域試驗的小麥品種（系）構建DNA 指紋圖譜，并對其進行遺傳差異分析，以期為小麥的品種改良和種質創新等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

為70份2009-2013年參加河北省小麥區域試驗的品種（系），分為4個組別，黑龍港節水組17個，冀中北水地優質組11個，冀中南水地組28個和優質組14個，由河北省種子管理站提供（表1）。

1.2 方法

1.2.1 SSR標記 選用均勻分布于小麥基因組的42對 SSR標記進行指紋圖譜構建和遺傳差異分析，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA提取 采用簡化的CTAB法［15］提取70份材料的基因組DNA，每份材料取20個種胚混為一個樣品提取總DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA的質量和濃度，總DNA 用0.1×TE稀釋至50 ng/μL備用。

1.2.3 PCR擴增、電泳與顯影 PCR 體系為10 μL，含 10×buffer 1.0 μL、10 mmol/L dNTP 0.2 μL、1.25 μmol/L引物 2.0 μL、2 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.25 μL、10 ng/μL模板DNA 3.0 μL、超純水3.55 μL。PCR 反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50-68℃（因引物而異）退火60 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸5 min，10℃保存。

PCR 產物用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離，采用簡化硝酸銀染色法顯色［15］。擴增產物的各種帶型按Wang 等［16］的方法賦值，構建84位數的參試品種 DNA指紋。

1.2.4 數據處理 采用 Power marker V3.25軟件［17］對等位變異數、基因多樣性和多態性信息量（PIC值）等進行分析。SSR引物的鑒別能力用PIC值表示，其計算公式為：PIC = 1-Σfi2，其中fi為I位點的基因頻率［18］。基因多樣性，是指群體內隨機選擇的等位基因間可能存在的差異，對于第i個座位的基因多樣性的無偏估計值為：H=（n/n-1）（1-∑Pij2），其中 n 為材料數，Pij為第i 個位點第j個等位變異的頻率。利用NTSYS 2.10 軟件計算各品種間Dice遺傳相似系數，采用非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析［19］。

2 結果

2.1 SSR標記多態性分析

42對SSR標記在70份材料中共檢測到303個等位變異（表2），每個DNA位點的等位變異為4-12個，平均為7.21個；其中最多的引物為Xgwm334，有12個等位變異；其次為Xgwm285、Xcfd29和Xcfd35均有11個等位變異；而Xgwm610、Xgwm333的等位變異僅為4個。引物在PIC值變化范圍為0.41-0.84，平均值為0.69，說明所采用的SSR引物對小麥品種的區分能力較好。比較了42個位點在A、B、D三個基因組的平均遺傳豐富度和遺傳多樣性指數，分別為6.94、6.53和7.50（D＞A＞B）和0.675、0.681和0.708（D＞B＞A）。結果表明，D基因組的遺傳多樣性較高。

2.2 小麥品種（系）DNA指紋圖譜分析

采用42個SSR標記對70份品種（系）進行DNA指紋分析（圖1），19個品種（系）具有特征等位變異，即某種等位變異僅有1個品種具有（表3）。其中硬B216-6、師欒08-4、滄麥2007-102和SH299在3個位點上具有特征等位變異，具有2個和1個特征等位變異的分別為7個和8個。但隨著群體材料變化，特征等位變異可能出現在其他品種上。引物“Xgwm334”可鑒別出衡08觀29、滄麥2007-140、科0801、石H083-366和SH299，引物“barc174”可鑒別濟067251、冀麥185和寶麥38，表明這兩對引物多態性豐富，鑒別能力較強，可以用于DNA指紋圖譜構建時的優選標記。

表1 小麥品種（系）信息

2.3 小麥品種（系）間遺傳差異分析

參試品系的遺傳相似系數（GS）為0.05-1.00，平均為0.28，品系間遺傳相似性變化較大。黑龍港節水組、冀中北水地優質、冀中南水地組、冀中南優質組平均遺傳相似系數分別為0.30、0.23、0.31和0.26，不同的區試組之間相差較小；其中科0901與邯農531遺傳相似系數最高，GS值為1.00；相似系數最低的為衡5317和邯07-6092。基因多樣性介于0.43-0.85之間，平均為0.73。以上結果表明，參試品系間存在不同程度的遺傳差異。

表2 SSR標記多態性分析

表3 19個小麥品種（系）特征等位變異

2.4 聚類分析

根據70份小麥品種（系）42個SSR位點的DNA指紋圖譜計算材料間Dice相似系數，進行UPGMA聚類分析。結果表明，在相似系數0.28處被分為4大類。

A類包括7個品種，均為參加優質組試驗，其中6個品種為冀中南優質組，河北師范大學和藁城市農業科學研究選育的分別有3個和2個。

圖1 30個小麥品種（系）Xbarc59位點的指紋圖譜

B類包括14個品種，又分為B1和B2亞類。B1亞類的4個品系均為河北農業大學育成。B2亞類包括10個品種，其中8個為參加冀中南水地組和優質組。其中濟067251、泰農18和SH299的育成單位來自山東省，其余5個品種均來自石家莊地區。

C類包括21個品種，又被分為C1和C2亞類。C1亞類包括6個品種，有4個為參加冀中北水地優質組試驗品種。C2亞類包括15個品種，其中參加冀中南區試的品種8個、黑龍港節水組6個，參試單位來自石家莊、邯鄲、邢臺、衡水和滄州地區。滄州市農林科學院參試的3個品種被聚在一起。

D類包括28個品種，占供試材料的40%，其中主要包括參加冀中南水地組的17個、黑龍港節水組7個及冀中北水優質組的3個品系。該組育種單位多集中在河北省中部，僅河北農業大學、石家莊市農科院和河北省農林科學院旱作所參試品種就有15份。

3 討論

本研究采用帶紋清晰、簡單、多態性好、重復性和穩定性高的42對SSR標記，為2009-2013年河北省區域試驗小麥品種（系）構建了DNA指紋圖譜，其中攜帶1-3個特征等位變異的品種有17份，因此利用1對引物即可將該品種與其他品種區分開。對于檢測的70份材料，除科0901與邯農531外，其余68個均能分開，表明所采用的SSR引物的品種鑒別能力較強。42對SSR標記在參試品種中共擴增出303個等位變異，每個DNA位點平均7.21個，PIC值平均0.69，均高于劉路平等［20］、陳先紅等［21］每對引物平均3.88和5.89個等位變異，以及PIC值為0.53和0.61的研究結果，表明采用的SSR標記對于構建70份河北省參試品種的DNA指紋圖譜具有較強的區分能力和代表性。因此，可作為河北省小麥品種DNA指紋數據庫的一部分使用。

潘玉朋等［22］對25份黃淮麥區近年大面積推廣品種進行分析，遺傳相似系數為0.34-0.85，平均為0.61；蒲艷艷等［13］采用68個SSR標記對44份山東省近期育成品種進行遺傳多樣性研究，品種間的遺傳相似系數為0.59-0.92，平均為0.69，兩者均表明所研究品種間的遺傳差異較小，遺傳基礎較窄。而本研究的70份材料的遺傳相似系數在0.05-1.00之間，平均0.28，參試品種間的遺傳相似系數變化幅度大，表明參加河北省區域試驗小麥品種（系）間遺傳差異較大，遺傳基礎相對豐富。分析原因，可能與參試品系的來源有關，既有河北省科研單位，又有中國農業大學、中國科學院、中國農業科學院、山東省育種單位；另一原因，按照國家冬小麥區域試驗分組，河北省中南部屬于黃淮麥區北片，而中北部屬于北部冬麥區，使得選育的小麥品種生態類型比較豐富。

通過聚類將70份材料分為四大類，A類所包含的材料均為參加優質組試驗，與其他類群中多數材料的遺傳差異較大。在四大類中，每個類群中均包括石家莊地區育種單位選育的材料，可能與該地區的育種單位所處于河北省的中部，使選育的品系有著較多的生態類型有關；而河北農業大學參試的9個品系，4個被分在B1亞類，5個分在D類；河北省農林科學院旱作所參試品種大多數被分D類，邯鄲、邢臺、滄州地區的參試品種均被分在C類。結果表明，同一地區或同一單位選育的品種多聚在相同類群，相似程度與育種單位或地區有著較明顯的關系，與王升星等［23］研究將同一麥區或者有共同系譜來源的小麥品種地聚為一類的結果較為一致。因而，在利用本地優良資源的同時，加大國內外優良資源的引進和利用，創制適應本地區的育種中間材料，從而更加豐富新育成品種的遺傳差異。

4 結論

本研究結果表明，采用42對SSR標記為2009-2013年參加河北省區域試驗小麥品種（系）構建的DNA指紋圖譜具有較強代表性，可作為河北省小麥品種的DNA指紋數據庫一部分使用。并利用DNA指紋數據進行區域試驗小麥品種（系）間的遺傳差異分析，表明參試品種的遺傳差異較大，但品種間的相似程度與育種單位或地區有著較明顯的關系。因而，DNA指紋圖譜對于小麥品種親緣關系鑒定是非常有效的技術手段。

致謝：特別感謝河北省種子管理站鮑聰和張力同志對本實驗材料的提供和幫助。

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（責任編輯 狄艷紅）

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of Genetic Diversity for Wheat Varieties（Lines）in Regional Test of Hebei

Li Hongbo1，2Pang Binshuang2Liu Lihua2Liu Yangna2Zhao Changping2Chen Jingtang1
（1. Department of Agronomy，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；2. Hybrid Technology Engineering Research Center of Wheat，Beijing Academy of Agriculture and Forestry，The Municipal Key Laboratory of Hybrid Wheat Molecular Genetic，Beijing 100097）

In order to provide a reference for improving and innovating breeding materials， we used forty two pairs of SSR primers to construct DNA fingerprints and detect genetic diversity among 70 wheat varieties（lines）， which participated in regional test of Hebei in 2009-2013. The results showed that 303 allelic were revealed on 42 SSR loci， 7.21 alleles were detected for each SSR locus， and the average PIC（polymorphism information content）value was 0.69. Moreover， the average gene diversity was 0.73， and the genetic similarity varied from 0.05 to 1.00 with the average of 0.28. These results indicated that there is a large genetic difference between the wheat varieties（lines）in regional test of Hebei. The cluster analysis divided the 70 wheat varieties（lines）into four groups and six subgroups by UPGMA method. These results show that the wheat varieties（lines）have similar genetic background in the same breeding institute or region. We should strengthen the introduction and utilization of foreign wheat germplasm resources.

wheat；SSR markers；DNA fingerprinting；genetic varieties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.034

2015-03-24

國家科技支撐計劃（2014BAD01B09，2013BAD04B01），北京市農林科學院科技創新重大專項（KJCX20140421，KJCX20140202）

李宏博，男，碩士研究生，研究方向：分子育種；E-mail：li-hb1208@163.com

陳景堂，男，博士，教授，研究方向：作物性狀遺傳改良；E-mail：chenjingtang@126.com趙昌平，男，博士，研究員，研究方向：小麥遺傳育種；E-mail：cp_zhao@vip.sohu.com