人參euFUL基因的克隆與生物信息學分析

郭雙雙 劉翠晶 韓梅 楊利民

（吉林農業大學中藥材學院 吉林農業大學省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室，長春 130118）

人參euFUL基因的克隆與生物信息學分析

郭雙雙 劉翠晶 韓梅 楊利民

（吉林農業大學中藥材學院 吉林農業大學省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室，長春 130118）

旨在研究人參（Panax ginseng C.A.Meyer）花的形成，根據GenBank數據庫中基因片段設計特異引物，利用cDNA快速末端擴增方法（RACE），克隆了人參花中一個5'端部分缺失euFUL（命名為PgFuL）的編碼區序列。獲得的PgFUL基因由867個核苷酸組成，編碼212個氨基酸。生物信息學分析結果顯示，PgFUL編碼蛋白分子質量為24.64 kD，等電點pI5.80，不含信號肽，無跨膜區。二級結構中α-螺旋結構占60.19%、延伸鏈占5.21%、無規則卷曲占34.60%。序列比對和系統進化分析表明，PgFUL人參PgMADS protein3（BAK20018.1）的序列同源性為100%，與加拿大蝙蝠葛（AGX01589.1）相似度達95%，屬于A功能基因中的euFUL進化系。

euFUL基因；生物信息學分析；基因克隆；人參

花是被子植物特有的生殖結構［1］。利用分子生物學和遺傳學對擬南芥、金魚草、矮牽牛花等模式植物研究發現，花的形成是受許多基因和代謝途徑所調控的復雜網絡［2］。該網絡中許多基因編碼轉錄因子，通過結合其他基因的調控區，激活或抑制他們的表達［3］。在參與花發育的過程中，大多數屬于MADS-box基因。

MADS-box基因是一個含有56-60個氨基酸的高度保守的 MADS 盒子的一類重要的真核生物轉錄調控因子基因家族，在真核生物的發育過程中，與靶基因的順式作用元件結合，通過調控生物的生長發育和信號傳導來發揮作用。首先是通過對擬南芥和金魚草的研究中發現其具有調控花器官發育方面的功能［4］，后來的研究報告中顯示其在果實發育、胚胎發育和營養器官的發育中也起著重要作用［5］，說明MADS-box基因是一個具有多種功能的超基因家族。

MADS-box基因編碼的與DNA結合的轉錄因子蛋白在植物、動物和真菌的基因組中均已被鑒定［6］，在過去的幾年中，有許多MADS-box基因從不同的植物種類中被分離。在植物從真菌和動物中分化之前發生了基因復制事件，產生了兩個主要的MADS-box基因類型，即I型和II型［7］。I型和II型MADS-box基因在動物和真菌負責各種途徑的轉錄與調控，包括生長發育的調控。在植物中，TypeⅠ型功能不是很清楚，所有已知功能的MADS-box 基因均屬于Type Ⅱ型，II型MADS-box基因可以進一步被分為MIKC*和MIKCc型，這兩種類型MADS-box基因的主要區別表現在I區和K區序列結構的差異［8］。大多數MIKCc型基因能編碼MADS-box蛋白，由4個具有特定功能的結構域組成，即MADSI-K-C domain。植物MIKCc型MADS-box基因由于其在花發育過程中的重要作用而受到生物學家的關注［9］，通過對擬南芥（Arabidopsis thaliana）和金魚草（Antirrhinum majus）等模式植物花器官發育的研究，提出闡釋被子植物花發育的簡單的ABC模型和ABCDE模型，將控制花發育的同源異型基因分為A、B、C、D、E五類基因。它們共同控制著萼片、花瓣、雄蕊、心皮及胚珠的形成和發育。

ABCDE模型中除了AP2不屬于MADS-box基因家族成員外，其余均是MADS-box基因不同亞家族成員。通過對處于系統進化不同地位的被子植物各類群中分離得到大量的MADS-box基因進行系統發育重建，將它們分為12個主要的亞家族［10］。在擬南芥植物中大多數的MADS-box基因只在花中表達，而 FUL卻在植物發育的不同特異階段表達。擬南芥中FRUITFULL（FUL）基因屬于花同源異型基因中的A類基因，位于第5條染色體。FUL和APETALA1（AP1）序列具有很高的相似性，屬于AP1/SQUA 基因亞家族。在AP1/SQUA亞家族的進化過程中至少發生了 4 次基因重復事件。在核心真雙子葉植物（core eudicots）中發生了兩次基因重復事件，結果產生了euAP1、euFUL 和FUL-like 3個進化系［11］。目前，從擬南芥中克隆出的3個A類基因，AP1、FUL、CAL 3個基因在控制花分生組織特異性發育的功能方面具有冗余性［12］，與AP1和CAL相比，FUL基因則具有廣泛的功能：它既能在花發育早期促進花序分生組織的形成，又能在花發育的晚期在心皮及角果中行使功能，同時該基因還影響葉片的發育［13］。

本研究根據GenBank已登錄的其他被子植物MADS-box基因保守區序列設計引物，利用cDNA快速末端擴增（RACE）技術克隆人參A功能MADS-box基因3'端cDNA序列，命名為pgFUL基因，運用生物信息學軟件對該基因序列結構進行分析，通過MEGA5.0構建系統發育進化樹分析它們的進化地位，旨在探究人參花發育的分子遺傳機理，為今后深入研究該基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 五年生栽培人參（Panax ginseng）于2014年6月初采自吉林省撫松縣撫南林場，利用剪刀將已開放的花序剪下放于自封袋中。采集后立即放于冰盒中保存，第2天回到實驗室立即用自來水沖洗3-5次，用吸水紙吸掉表面水分，用滅過菌的鑷子將花放于凍存管中，立刻置于液氮速凍，-80℃保存備用。

1.1.2 試劑 EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR Mastermix；質粒提取試劑盒；多功能DNA純化回收試劑盒；DNA連接試劑盒等均購自北京百泰克生物科技有限公司；JM109感受態菌株購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 PCR擴增儀（Mastercycler nexus）；-80℃超低溫冰箱（SANYO）；低溫冰箱（BCD-268 TN，青島海爾股份有限公司）；凝膠成像系統（GIS-2010，天能科技（上海）有限公司）；制冰機（SIMF140，SANYO）；高速冷凍離心機（HC-2518R，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS，上海申安醫療器械廠）；恒溫水浴槽（北京精科華瑞儀器有限公司）；培養箱（北京議嘉林科技有限公司）；電泳儀（DYY-8C型，北京六一電泳廠）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成 取人參花樣品，在液氮中研磨，依據艾德萊生物公司的EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒的操作步驟提取人參總RNA，用0.7% 的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。利用生工生物工程股份有限公司的Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase反轉錄酶，按照該試劑盒提供的步驟和反應條件將RNA反轉錄成第一鏈互補鏈DNA（cDNA）。

1.2.2 PgFUL基因的擴增與測序 根據PgFUL的cDNA片段序列設計3'-RACE擴增特異引物，上游引物為：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTCGCCGGCGACATCCTAGGCC-3'，下游引物為：5'-CTAGAGYACKCGRAAGAASTC-3'，cDNA模板為3'-RACE第一鏈cDNA，20 μL反應體系：1.0 μL cDNA、9 μL 2×Taq Mix、上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L）、8.4 μL ddH2O。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，48℃30 s，72℃ 1 min，10個循環；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環；72℃ 10 min，4℃保溫。0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對擴增所得目的片段進行切膠回收。

將回收產物與pMD20-T載體連接，再轉化到JM109感受態菌株中進行克隆，涂布在含有X-gal、IPTG和Amp的LB平板上于37℃進行培養，挑取白色菌落單克隆經菌落PCR擴增和電泳檢測后選擇陽性克隆送公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 將所測定的序列結果在NCBI通過Blast搜索蛋白質和核苷酸數據庫，并由DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，使用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.g ov/gorf/gorg.html）查找開放閱讀框（ORF）。生物信息學分析主要采用一些網上軟件包進行分析，進行信號肽預測Signal P4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），如采用Expasy中的工具ProtParam進行理化性質預測（http：// web.expasy.org/protparam/），TargetP 1.1（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析亞細胞定位，TM-pred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html）進行跨膜域預測。

采用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy. org/）進行二級結構的分析。用DNAMAN軟件對序列進行多重比對，用ClustalW軟件與其他植物中的MADS-box氨基酸序列進行比較，用MEGA5.1軟件構建Neighbor-Joining系統進化樹，bootstrap重復次數為1 000次。

2 結果

2.1 人參PgFUL基因的克隆

將提取的人參花的總RNA經0.7%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可知28S rRNA與18S rRNA條帶寬度和亮度比接近2∶1，說明RNA提取的完整性較好，未發生明顯的降解（圖1-A）。根據PgFUL的cDNA片段序列設計3'-RACE擴增特異引物，cDNA模板為3'-RACE第一鏈cDNA進行PCR擴增，PCR產物經0.7%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，獲得的片段大小約為867 bp，結果（圖1-B）顯示，使用pMD20-T載體通用引物對白色菌落的單克隆進行菌落PCR檢測，結果如圖1-C所示，選取白色菌落中的陽性克隆菌送去測序。

2.2 缺失部分5'端堿基的PgFUL及其編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 PgFUL cDNA測序結果及其編碼蛋白的理化性質 對測序結果校對并分析確定已克隆的cDNA，全長867 bp，具有639 bp的CDS和228 bp 3'端非翻譯區（untranslated region，UTR），編碼由212個氨基酸殘基組成的蛋白質（圖2）。通過ProtParam對該蛋白理化性質的分析，結果表明該蛋白分子式為C1074H1727N305O338S10，總原子數為3 454。其分子量是24.64 kD，pI5.80。帶正電殘基（Arg+Lys）28，帶負電殘基（Asp+Glu）34，不穩定指數為56.28，表明該蛋白不穩定。脂溶指數為86.51，總平均親水性為-0.753，表明該蛋白為親脂性蛋白。

2.2.2 PgFUL編碼蛋白二級結構分析及結構域預測 采用SWISS_MODEL對PgFUL編碼的蛋白進行二級結構的分析和結構域的預測。PgFUL的編碼蛋白二級結構中α-螺旋（alpha helix）占60.19%、延伸鏈（extend strand）占5.21%、無規卷曲（random coil）占34.60%。

圖2 cDNA缺失部分堿基的PgFUL基因

InterproScan的結構域預測結果（圖3）表明，PgFUL編碼蛋白含有兩個保守結構域，一個是轉錄因子MADS-box結構域（Transcription factor MADS-box domain，IPR002100），位于氨基酸殘基的1-31位之間，或1-33位、1-67位之間，另一個是轉錄因子K-box結構域（Transcription factor K-box domain，IPR002487），位于氨基酸殘基的47-146位之間。

圖3 InterproScan對PgFUL基因編碼蛋白結構域預測結果

2.2.3 PgFUL基因氨基酸序列同源性分析 將PgFUL基因的氨基酸序列于GenBank數據庫中進行blastp比對，獲得與其具有同源性較高的A功能MADS-box氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進行同源性分析。結果（圖4）顯示，由同源性比對結果可知，Panax g FUL2和GenBank數據庫中的Panax g FUL1（BAK20018.1，Panax ginseng）屬于同一序列，序列相似度100%，與八仙花APETALA1/FRUITFUL、咖啡樹FUL、大桉EUGRSUZ_K02547、金魚草euFUL、蘋果MdMads2.1的氨基酸序列具有較高的序列相似性。euFUL進化系和FUL-like進化系成員的C末端結構域擁有FUL motif和paleoAPl motif，euAP1進化系成員均擁有FUL motif和euAPl motif。Panax gFUL2蛋白的C末端結構域擁有保守的FUL motif和paleoAPl motif，而不具有euAPl motif，表明Panax g FUL2基因可能屬于A功能基因中的euFUL進化系。

圖4 部分A的功能基因的氨基酸序列進行比對結果

2.2.4 PgFUL編碼蛋白信號肽、亞細胞定位、跨膜區預測分析 應用在線Signal 4.1 Server 軟件分析結果表明PgFUL編碼蛋白不含信號肽。在線工具TargetP 1.1 Server預測該蛋白定位于細胞質中，使用TMHMM Server v.2.0預測PgFUL編碼蛋白跨膜區域，結果顯示無跨膜區域，PgFUL整條肽鏈都位于細胞膜外，即PgFUL不存在跨膜結構域。結合上述轉運肽的預測，可以推斷，PgFUL也是在細胞質基質中合成后，沒有經過蛋白轉運，直接錨定于細胞質基質中的特定部位行使催化功能。

2.2.5 PgFUL編碼蛋白系統進化樹分析 為了分析pgFUL編碼蛋白的進化情況，從GenBank數據庫中共選取了22條A功能基因的序列，經過軟件Clustal W比對，并利用MEGA5.1中的Neighbor-Joining方法［14］，構建了包括核心真雙子葉植物、基部被子植物和基部真雙子葉植物的系統進化樹。樹枝長度用比例尺表，其中FUL Panax ginseng代表本研究利用3'-RACE克隆得到的缺失部分5'端目的片段。系統發育樹分析（圖5）顯示，A功能基因包括4個進化系：擬南芥AGL79單獨為一支、FUL-like為一支、euAP1為一支、FUL Panax ginseng基因與加拿大蝙蝠葛（AGX01589.1）相似度達95%，同屬于類別euFUL為一支。故PgFUL基因屬于A功能基因中的euFUL進化系。

圖5 利用從人參中克隆得到的PgFUL基因編碼的蛋白序列與其他植物中的A功能基因的氨基酸序列構建系統發育樹

3 討論

人參是多年生傳統的中藥材，3年生以上的植株每年均可開花，開花時間7-15 d，其中8-10 d居多，種子具有后熟現象。MADS-box基因家族具有調控植物花的形成、果實的發育以及營養生長等方面的作用。本研究通過克隆PgFUL基因，生物信息學分析預測基因的保守結構域及基因功能［15，16］。基于生物信息學分析，分別對PgFUL蛋白氨基酸序列的理化性質、二級結構、結構域、蛋白信號肽、亞細胞定位和跨膜區進行預測分析，但預測結構和性質仍需試驗驗證。

利用MEGA5.10軟件，通過搜索GenBank數據庫上與所克隆人參PgFUL氨基酸序列進行同源性分析和系統進化分析。PgFUL和GenBank數據庫中的Panax g FUL1（BAK20018.1，Panax ginseng）相似度達100%，可以認定二者為同一種蛋白氨基酸序列。PgFUL蛋白氨基酸的C末端結構域擁有保守的FUL motif和paleoAPl motif，而不具有euAPl motif，與洋蔥的AcFUL基因的C末端結構域相同［17］，進一步通過系統進化樹分析表明PgFUL基因可能屬于A功能基因中的euFUL進化系。褚婷婷等［18］克隆得到擬南芥FRUITFULL（euFUL）基因啟動子區與其第一內含子，對FRUITFULL基因表達起到重要的調控作用。A功能基因在被子植物中發生了兩次基因重復事件，在被子植物形成之前的重復事件產生了FUL-like、euFUL和euAP1三個進化系。由于FUL基因在控制植物開花結果方面的特殊作用，隨著對其深入的研究，相信在農業生產、品種改良等方面將取得巨大成就。

PgFUL基因僅是人參MADS-box基因家族中的一個成員，其功能仍需進一步研究，為了解人參花形成、果實發育及營養生長過程，在后續研究中需要克隆人參MADS-box基因家族的其他成員，分析各自的基因功能，研究各成員之間是否存在協同作用或功能冗余。

4 結論

通過克隆獲得的PgFUL基因由867個核苷酸組成，編碼212個氨基酸。生物信息學分析結果顯示，PgFUL編碼蛋白分子質量為24.64 kD， 等電點pI5.80，不含信號肽，無跨膜區。二級結構中α-螺旋結構占60.19%、延伸鏈占5.21%、無規則卷曲占34.60%。與加拿大蝙蝠葛（AGX01589.1）相似度達95%，同屬于類別euFUL為一支。故PgFUL基因屬于A功能基因中的euFUL進化系。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Bioinformatics Analysis of euFUL Gene in Panax ginseng

Guo Shuangshuang Liu Cuijing Han Mei Yang Limin
（State Key Laboratory for Ecological Restoration and Ecosystem Management of JLP-MOST Collective Construct-KLUER，College of Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

To study the flower development of Panax ginseng， designing specific primers according to gene fragments in the GenBank data， and the 5' end deletion coding sequence of a euFUL（named PgFUL）gene in ginseng flower was cloned by the rapid amplification of cDNA ends（RACE）. PgFUL consists of 867 nucleotides， and encoding a protein of 212 amino acids. The bioinformatics analysis shows that PgFUL-encoding protein has isoelectric point（pI）of 5.80 and a calculated molecular weight about 24.64 kD without transmembrane region and signal peptide. In the secondary structure， the percentage of α-helix， extended strand and random coil are 60.19%， 5.21% and 34.60%，respectively. The homologous analysis by sequence alignment and phylogenetic indicates that PgFUL is in 100% similarity with ginseng PgMADS protein3（BAK20018.1）and 95% with Menispermum canadense（AGX01589.1）， which belongs to evolutionary euFUL in functional gene A.

euFUL gene；bioinformatics analysis；gene cloning；Panax ginseng

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.019

2014-10-26

國家自然科學基金項目（31270371，31200178），國家科技支撐計劃項目（2011BAI0301-02），吉林省科技成果轉化項目（20125068）

郭雙雙，男，碩士生研究生，研究方向：微生物及分子生物學；E-mail：1530811226@qq.com

楊利民，男，博士，教授，研究方向：中藥資源生態與藥材質量調控研究；E-mail：ylmh777@126.com