一株好氧反硝化-異養硝化菌的篩選及脫氮特性研究

連紅民 邱忠平 何昆明 周文秀

（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

一株好氧反硝化-異養硝化菌的篩選及脫氮特性研究

連紅民 邱忠平 何昆明 周文秀

（西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

針對滲濾液中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮難以轉化的問題，從好氧生物反應器填埋場中篩選出一株好氧反硝化菌-異養硝化菌HN，初步鑒定該菌為假單胞菌（Pseudomonas）。通過對不同氮源的生物轉化作用研究了HN的脫氮特性，并對其脫氮條件進行了優化。結果表明，在有氧條件下，以硝酸鉀為唯一氮源，HN在96 h時對硝酸鹽氮的去除率達到95.44%；以硫酸銨為唯一氮源時，HN在60 h時對氨氮的去除率達到85.14%；當碳源為乙醇，碳氮比為7∶1，初始pH為7.5，溫度為35℃，接種量為10%時，菌株HN脫氮效率最高。

生物脫氮；好氧反硝化；異養硝化；假單胞菌

滲濾液是垃圾填埋過程中產生的廢水，具有化學需氧量（Chemical oxygen demand，COD）高，氨氮濃度高的特點［1］，但其生化需氧量（Biochemical oxygen demand，BOD）與總氮（Total nitrogen，TN）的比值較低，造成反硝化難以進行、硝酸鹽氮累積、TN去除率低的問題［2］。生物脫氮法具有高效、安全、經濟等優點，是目前污水脫氮最常用的技術。但傳統的生物脫氮過程是由相互獨立的好氧硝化與厭氧反硝化構成，兩個反應階段的作用菌群及環境要求各異，造成脫氮工藝復雜，在一定程度上限制了生物脫氮的應用［3］。好氧反硝化是微生物在有氧條件下，利用氧和硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體，將硝酸鹽和亞硝酸鹽還原為氣態氮氧化物的過程［4，5］。與傳統的厭氧反硝化相比，好氧反硝化使硝化/反硝化在同一個反應器中進行，可以大大減少占地面積和建設資金，縮短處理周期；同時，在運行過程中不需補充碳源和調節pH，節約了成本［6］。一些好氧反硝化菌同時具有異養硝化的性能［7］，這個發現進一步豐富了同步硝化反硝化理論，為反應器中的同步硝化反硝化提供了可能。

好氧反硝化菌在20世紀80年代首次被發現［8］，關于好氧反硝化菌的篩選、鑒定與反硝化特性的研究，科研人員已有諸多嘗試［9-11］，但是針對滲濾液中氮素轉化的好氧反硝化菌的研究還鮮見報道。本研究從好氧生物反應器填埋場中篩出一株好氧反硝化菌，對其初步鑒定后，研究該菌的好氧反硝化性能與異養硝化性能，并優化脫氮條件，旨在為滲濾液生物脫氮提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 含菌樣品 含菌樣品取自課題組填埋5個月好氧生物反應器填埋場內的填埋垃圾。

1.1.2 培養基 基礎培養基：牛肉膏1.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，蒸餾水1 000 mL。

馴化培養基：檸檬酸三鈉5.0 g，KNO31.2 g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO41.0 g，K2HPO43.0 g，NaCl 0.5 g。

溴百里香酚藍（BTB）初篩培養基：瓊脂20 g，KNO31 g，KH2PO41 g，FeCl2·6H2O 0.5 g，CaCl2·7H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸鈉8.5 g，BTB（1%乙醇溶液）1 mL，用1 mol/L的NaOH調節pH7.0-7.3，121℃滅菌20 min。

反硝化培養基：KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl20.05 g，K2HPO41 g，KNO31 g，碳源、氮源可根據實驗需求進行調整。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與初步鑒定 使用QYC-200型全溫振蕩搖床（上海福碼實驗設備公司），通過菌體對數生長期轉接以及逐漸增加培養基中馴化培養基比例的方式進行富集馴化。菌株的形態試驗根據文獻［12］進行。生理生化鑒定使用細菌生理生化鑒定試劑盒，按照操作說明進行鑒定，結果根據文獻［13］進行分析。

1.2.2 菌株脫氮特性研究

1.2.2.1 好氧反硝化特性 保存的菌種在反硝化培養基中活化1 d后，以5%的接種量接種到裝有100 mL反硝化培養基（以硝酸鉀為唯一氮源）的250 mL錐形瓶中，在恒溫搖床中進行培養，設定溫度30℃，轉速200 r/min。每隔8 h取一次樣，測定培養液中的pH、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮及總氮濃度，至反應穩定。以不接種的液體培養基為空白對照，并設置平行實驗。

1.2.2.2 菌株的異養硝化特性 異養硝化-好氧反硝化菌的一個特征就是pH會先降低后升高。在異養硝化階段，菌株利用氨氮生成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，同時產酸；好氧反硝化將硝酸鹽氮轉化成氣體排出，完成脫氮反應，同時這是一個產堿過程，可以中和異養硝化過程中產生的酸，使pH保持相對穩定［14］。

以硫酸銨為唯一氮源，菌種活化1 d后，以5%的接種量接種到100 mL硫酸銨培養基中，在恒溫搖床中進行培養，設定溫度30℃，轉速200 r/min。每隔一段時間檢測一次培養液中的pH、氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮濃度，至硫酸銨濃度穩定。以不接種的液體培養基為空白對照，并設置平行實驗。

1.2.3 菌株最佳脫氮條件的研究 選擇對菌株生長和脫氮影響比較顯著的碳源、碳氮比、初始pH、溫度和接種量為單因素變量，對HN菌株脫氮條件進行優化。將菌種活化1 d后，接種到單因素變量培養基中，培養24 h后測定硝酸鹽氮濃度和OD600。

1.2.3.1 碳源 反硝化實質上是氮的還原［15］，碳源作為電子供體。分別以無水乙醇、三水合乙酸鈉、琥珀酸鈉、蔗糖、葡萄糖為唯一碳源，測定24 h后培養基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.2 碳氮比 碳氮比主要影響細菌在生長與合成之間的關系，對細菌的代謝活動影響很大［16］。設置碳氮比為1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、10∶1、12∶1，測定24 h后培養基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.3 初始pH pH能夠對菌體內酶活性產生不同影響，改變細胞膜上的電荷，影響微生物對營養物質的吸收，甚至能夠改變有害物質對生物體的毒性［17］。設定初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，測定24 h后培養基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.4 溫度 溫度影響酶的活性。設定20℃、25℃、30℃、35℃和40℃五個溫度梯度，測定24 h后培養基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.5 接種量 在環境中能源一定時，接種量可以通過菌群數量大小來對微生物的生長及生命活動產生影響。按1%、5%、10%、15%和20%五種不同的接種量進行實驗，測定24 h后培養基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.6 優化后菌株的脫氮效率 根據之前實驗結果，以無水乙醇為碳源，硝酸鉀為唯一氮源，碳氮比設為7∶1，初始pH為7.5，培養溫度35℃，接種量為10%，考察菌種對硝酸鹽氮的去除效率。

1.2.4 分析方法 NO3-N濃度的測定采用酚二磺酸分光光度法，NO2-N濃度的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，氨氮濃度的測定采用納氏試劑分光光度計法，總氮采用過氧化鉀氧化-紫外分光光度法，菌體生長吸光度（OD600）采用比濁法測定（用721可見分光光度計在光密度為600 nm處測定菌液吸光度值）。

2 結果

2.1 菌株的篩選與初步鑒定

在BTB固體培養基上劃線，反硝化菌使pH升高，培養基變藍色，如圖1所示。挑選有藍色反應的菌落進一步劃線篩分，最終篩出1株具有好氧反硝化能力的單菌，編號為HN。

圖1 不同時期BTB培養基的顏色

菌株HN在液體反硝化培養基中培養3 d后，培養基中有綠色熒光物質產生；菌落形態：黃白色，圓形，半透明，表面光滑，邊緣不整齊；革蘭氏染色陰性，短桿狀。生理生化反應：氧化酶實驗陽性；葡萄糖氧化發酵（O/F）實驗為有氧氧化，產酸不產氣；精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、乙酰胺均為陽性；蔗糖、麥芽糖、木糖、DNA實驗為陰性；不液化明膠，不水解淀粉。根據上述形態學特征和生理生化反應，初步鑒定HN為假單胞菌（Pseudonomas sp.），命名為Pseudonomas HN。

2.2 菌株脫氮特性研究

2.2.1 好氧反硝化特性 圖2顯示，在實驗開始的12 h內，菌株處于適應期，反硝化酶活性很低；亞硝酸鹽氮有一定積累，pH從6升高到7.5，表明HN最先產生硝酸鹽氮還原酶，將硝酸鹽氮還原成亞硝酸鹽氮，使pH升高。12-60 h之間，總氮和硝酸鹽氮濃度快速降低，分別從157 mg/L和117 mg/L降低到20.6 mg/L和16.3 mg/L，同時，亞硝酸鹽氮濃度保持穩定水平，pH穩定在7.5。60 h后，總氮和硝酸鹽氮濃度下降緩慢，到96 h時分別穩定在9.6 mg/L和6.7 mg/L，去除率分別達到94.11%和95.44%。

圖2 以硝酸鉀為唯一氮源時HN的好氧反硝化特性

2.2.2 菌株的異養硝化特性 圖3顯示，HN對氨氮的轉化過程可以概括為兩個階段：0-24 h內是硝化階段，氨氮濃度迅速降低，從172 mg/L降低到29.6 mg/L，去除率為82.79%；硝酸鹽氮在24 h時積累到最大量7.66 mg/L，pH下降，到最低值6.5，有很少的亞硝酸鹽氮積累。24 h以后是反硝化階段，氨氮去除速度變慢并趨于穩定，最終濃度為25.5 mg/L，去除率為85.17%；硝酸鹽氮濃度下降至最終消失，同時亞硝酸鹽氮有一定積累，pH升高，抑制了硝化反應的進行。

2.3 菌株最佳脫氮條件的研究

2.3.1 碳源 圖4顯示，在以無水乙醇和琥珀酸鈉為碳源的培養基中，HN生長情況最好，OD600達到0.876，硝酸鹽氮的去除率也最高，達到了99%；而在三水合乙酸鈉為碳源的培養基中，HN生長緩慢，OD600只有0.005，對硝酸鹽氮的去除率最低，為38.5%。表明碳源可以通過影響菌的生長來影響其反硝化效率，HN的最適碳源為無水乙醇。

圖3 以硫酸銨為唯一氮源時HN的異養硝化特性

圖4 碳源對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.2 碳氮比 圖5顯示，經過24 h培養，碳氮比為7時，HN的生長狀況最好，OD600為0.928，脫氮效率也最高，達到99.5%。碳氮比為1時，碳源提供的能量不足，限制了菌株的生長，OD600只有0.395，脫氮率只有47.2%；碳氮比為12時，由于乙醇對微生物有毒害作用，菌株的生長狀況反而變差，OD600為0.705，脫氮效率變低，為90%。綜合考慮，選擇7∶1為最佳碳氮比。

圖5 碳氮比對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.3 初始pH 圖6顯示，經過24 h培養，初始pH為7.5時，HN的生長狀況最好，OD600為0.94，硝酸鹽氮去除率達到了100%；初始pH在6-7之間時，HN的生長狀況都很好，OD600在0.90左右，脫氮效率都達到了98%以上，表明在偏酸的環境中，HN可以通過自身的反硝化產堿調節環境pH，使pH維持在中性偏堿；當初始pH調節到8時，HN的生長和脫氮都受到了很大的抑制，OD600只有0.018，脫氮率降到了14.7%。綜合考慮，選擇pH7為HN的最適初始pH。

圖6 初始pH對HN菌株生長和反硝化效率的影響

圖7 溫度對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.4 溫度 圖7顯示，溫度為35℃時，HN菌株的生長狀況最好，OD600為0.941，對硝酸鹽氮的去除率也最高，達到了96.6%。溫度過高或過低時都會影響菌體的生長狀況，20℃時脫氮率為38.3%，40℃時的脫氮率為68%。

2.3.5 接種量 圖8顯示，在1%-10%的接種范圍范圍內，接種量越大，菌液濃度越高，其反硝化性能越強，10%接種量時，OD600和脫氮率均最高，分別為0.915，97.7%。當接種量超過10%之后，菌株的脫氮率下降到97.2%；接種量超過15%時，菌液濃度和硝酸鹽氮的去除率均有較為明顯的下降，OD600為0.903，脫氮率為95.5%。推測原因是培養基內營養無法滿足全部菌體的生長，導致細菌的反硝化性能無法發揮到最佳狀態。綜上所述，HN菌株的最佳接種量為10%。

圖8 接種量對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.6 優化后菌株的脫氮效率 圖9顯示，實驗開始后16 h時，硝酸鹽氮濃度從138 mg/L降低至35.1 mg/L，去除率達到了74.2%，亞硝酸鹽氮濃度為5.12 mg/L。到48 h時，硝酸鹽氮被完全轉化，亞硝酸鹽氮也只有少量積累，有1.46 mg/L。說明在優化條件下，菌株適應期更短，且對硝酸鹽氮的去除能力更強。

圖9 優化后菌株的反硝化效率

3 討論

在已有報道中，好氧反硝化菌主要存在于副球菌屬（Paracoccus）、假單胞菌屬（Psuedomonas）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）和芽孢桿菌屬（Bacillus）中［18］，其中假單胞菌屬包括施氏假單胞菌［19］、產堿假單胞菌［20］及惡臭假單胞菌［21］。本研究所得菌株初步鑒定為假單胞菌屬的熒光假單胞菌，接下來通過分子鑒定進一步確認后，對研究好氧反硝化菌的生態學有一定參考價值。已報道菌株大多分離自活性污泥、農田土壤以及生活污水，在較低的氨氮或硝酸鹽氮濃度下對總氮有較好的去除率。陳茂霞等［22］從活性污泥中篩選到一株異養硝化-好氧反硝化菌，以氨氮、亞硝氮、硝氮為唯一氮源，當濃度為150 mg/L時，24 h總氮去除率分別為77.71%、53.34%和56.80%。而HN分離自生物反應器填埋場，對滲濾液有天然親和力，結果表明，HN在氨氮、硝氮濃度較低時的脫氮表現良好，下一步可以將HN添加到滲濾液處理工藝中，檢驗其對高濃度氨氮和硝氮的去除能力。

好氧反硝化菌使硝化反硝化能夠在同一單元內實現，研究人員還發現，即使在單一微生物體內也能完成將氨氮轉化為氣態產物的過程。Richardson等［23］研究了同步異養硝化-好氧反硝化的脫氮機理：菌體內有兩種酶，一種是氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化鎂（HAO），分別催化氨氮氧化為羥胺、羥胺轉化為亞硝酸鹽的過程；另一種是周質硝酸鹽還原酶類（NAP），可以把硝酸鹽轉變為亞硝酸鹽，最終轉化為氣態產物。結果顯示，異養硝化-好氧反硝化過程中pH先降低后升高：菌株首先利用氨氮生成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，同時產酸；硝酸鹽氮經過反硝化過程轉化成氣體排出，同時產堿，使pH保持相對穩定，這在一定程度上驗證了異養硝化-好氧反硝化的脫氮機理。

4 結論

從好氧生物反應器填埋場的填埋垃圾中分離得到一株具有好氧反硝化能力的菌株，初步鑒定為假單胞菌（Pseudonomas sp.），命名為PseudonomasHN。菌株HN在以硝酸鉀為唯一氮源時，對硝酸鹽氮去除率達到了95.4%，pH穩定在7.5，有少量亞硝酸鹽氮積累；以硫酸銨為唯一氮源時，對氨氮去除率達到了85.2%，pH先降低到6.5，再升高，最后穩定在7.5，有少量亞硝酸鹽氮的積累。表明菌株HN具有異養硝化-好氧反硝化特性。當碳源為乙醇，碳氮比為7∶1，初始pH為7.5，溫度為35℃，接種量為10%時，菌株HN脫氮效率最高，在48 h內對硝酸鹽氮的去除率達到100%。

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（責任編輯 馬鑫）

Screening and Denitrification Characteristics of an Aerobic Denitrifying-Heterotrophic Nitrification Bacterium

Lian Hongmin Qiu Zhongping He Kunming Zhou Wenxiu
（School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031）

Aiming at the fact that the degradation of NO3-N and NO2-N in leachate is difficult， an aerobic denitrifying bacterium HN，preliminary identified as Pseudomonas， was isolated from an aerobic biological reactor landfill. Based on its degradation capacities to different nitrogen sources， we studied the denitrification characteristics of HN and optimized the conditions for denitrification. The results showed that under aerobic conditions and potassium nitrate as sole nitrogen source， the removal efficiency of nitrogen in nitrate was up to 95.44% at 96 h；when using ammonium sulfate as sole nitrogen source， HN could remove 85.14% nitrogen in ammonia at 60 h；when the carbon source was ethanol， C/N was 7∶1， initial pH was 7.5， the temperature was 35℃ and inoculation amount was 10%， HN had the highest removal efficiency.

biological denitrification；aerobic denitrification；heterotrophic nitrification；Pseudomonas

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.021

2014-09-19

四川省科技支撐計劃（2015NZ0097），2015年研究生創新實驗實踐項目（YC201410225），2014年西南交通大學國創項目（201410613055）

連紅民，男，碩士研究生，研究方向：環境生物技術；E-mail：leehon20085132@163.com

邱忠平，女，博士，副教授，研究方向：環境生物技術；E-mail：zhpqiu@sina.com