幾株非模式白腐菌降解能力的研究

吳雪君 崔寶凱

（北京林業大學微生物研究所，北京 100083）

幾株非模式白腐菌降解能力的研究

吳雪君 崔寶凱

（北京林業大學微生物研究所，北京 100083）

利用愈創木酚選擇培養基，從11種白腐菌株中定性篩選出3株白腐菌，分別是氈毛栓孔菌Trametes velutina Dai 10149、鍺栓孔菌T. ochracea Cui 6888、絨毛栓孔菌T. pubescens Cui 7571。重量法繪制它們的生長曲線，同時測定其蛋白質含量及胞外酶活。通過比較發現，絨毛栓孔菌T. pubescens Cui 7571的生長速度快，且具有較強及穩定的酶活分泌能力；對針葉植物、闊葉植物及單子葉草本的木質纖維素均表現出較好的降解效果。

白腐菌；生長曲線；酶活；組分含量；降解能力

白腐真菌（white rot fungi，WRF）是自然界中一類可以分泌木質素降解酶的真菌［1］。白腐菌能降解各種結構相異的化學物質，包括在環境中持久且難以處理的污染物，具有其他生物系統所不具備的優點［2］。近年來，白腐菌被廣泛應用在生物制漿、生物漂白、廢水處理、染料脫色以及制備生物乙醇等領域中［3-6］。白腐真菌是木材腐朽菌中最大的類群，包括大部分木生擔子菌、少數子囊菌和半知菌種類［7，8］。近年來，對于白腐菌降解木質纖維素基質的報道很多，但大都集中在少數模式菌株，如黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、蟲擬蠟孔菌Ceriporiopsis subvermispora、云芝栓孔菌Trametes versicolor、南方靈芝Ganoderma australe、毛革蓋菌Stereum hirsutum、射脈革菌Phlebia radiata、糙皮側耳Pleurotus ostreatus、香菇Lentinus edodes 等菌株［9］。我國真菌資源豐富，已發現木材腐朽菌種類達1 100種［10-12］，其中白腐真菌種類占85%左右，很多非模式白腐菌菌株也具有良好的降解特性，因此開展不同種類白腐真菌的基礎研究具有重要意義。本實驗先利用愈創木酚培養基初步篩選出能夠高效氧化降解木質素的3個菌株；用重量法繪制3種白腐真菌的生長曲線；同時測定不同時期的各個真菌的胞外酶活。最后通過化學組分高低來評價真菌對不同木質纖維素材料的降解能力。旨在為生物降解等方面的研究提供有力高效菌株，并為探究木質素氧化降解能力以及發酵實驗提供酶學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 11株白腐真菌于2004-2012年采自中國9個省，具體采集地點和寄主記錄見表1。所有菌株均保藏于北京林業大學微生物研究所。

1.1.2 培養基 麥芽瓊脂平板培養基的組成（g/L）：葡萄糖 10 g，麥芽浸粉 20 g，KH2PO43 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 L。

酵母浸粉液體培養基的組成（g/L）：酵母浸粉 5 g，葡萄糖20 g，MgSO40.5 g，VB10.01 g，KH2PO41 g，蒸餾水 1 L。

愈創木酚選擇培養基的組成（g/L）：愈創木酚1 g，酒石酸銨0.1 g，蛋白胨2.6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，Na2HPO40.2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 愈創木酚培養基初步篩選高效白腐真菌 進行白腐真菌培養時，利用愈創木酚作底物能形成鮮艷而均勻的紅棕色氧化帶，且其顏色深淺、帶寬能較好地反應木質素降解酶的活性［13］。通過測量菌絲圈直徑與變色圈直徑的比值，可以篩選出產木質素降解酶的高效菌株。將1塊白腐真菌菌塊接到愈創木酚培養基上，并置于28℃ 恒溫培養箱中避光培養10 d，檢查菌落外變色圈的形成情況并記錄，見表1。各設置3次重復，利用十字交叉法計算菌絲圈以及變色圈直徑。

1.2.2 活化菌種及制備接種液 篩選出的高效白腐真菌菌株接于固體培養基上活化5 d，利用0.6 cm打孔器打孔，將5塊菌餅接于液體培養基中［14］，在28℃恒溫培養箱避光培養5 d，轉速150 r/min，后取出放在-4℃冰箱中儲存。制備接種液時，將活化后的白腐真菌液體懸浮液勻漿30 s，轉速5 000 r/min，吸取10 mL接于酵母浸粉液體培養基中，在28℃恒溫培養箱避光培養，轉速150 r/min。

1.2.3 重量法繪生長曲線 接種液接于液體培養基中，避光培養2 d后，每隔8 h準確量取10 mL菌液，濃鹽酸調節pH3，送入離心機進行離心分離，轉速12 000 r/min，時間10 min，倒去上清液，加無菌水再次離心分離，倒去上清液，將沉淀送干燥箱105℃下，烘干至恒重，自然冷卻后取出稱量，算出菌體濃度（g/L）。

1.2.4 考馬斯亮藍G-250染色液的配制［15］秤取考馬斯亮藍 G-250 0.1 mg，將其溶于50 mL 90%的乙醇中，再加入100 mL 85%的磷酸，后定容至1 L，混合均勻后，放于棕色瓶中存放。

1.2.5 蛋白質標準曲線的繪制 稱取10 mg牛血清白蛋白，定容至100 mL，取12支聚塞試管，編號1、2、3、4、5、6，并做平行試驗，按梯度加入牛血清蛋白試劑、蒸餾水及5 mL考馬斯亮藍染色液后，定容至25 mL，紫外分光光度計下測量595 nm處吸光值，并記錄。以蛋白質濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標則可繪出蛋白質標準曲線。

1.2.6 DNS溶液配制 酒石酸鉀鈉 182 g 溶于500 mL蒸餾水中，加熱溶解，依次加入3，5-二硝基水楊酸 0.3 g，NaOH 21 g，苯酚5 g，注意應在加入3，5-二硝基水楊酸后立刻加入NaOH。配好后靜置7 d則可使用，有效期是6個月，應注意放于棕色瓶中避光保存。

1.2.7 蛋白質測定 考馬斯亮藍染色法：酸性條件下，棕紅色的考馬斯亮藍與蛋白質通過疏水力相結合，生成藍色絡合物，在595 nm波長處有最大吸收峰值。取0.5 mL粗酶液，加入 5 mL 考馬斯亮藍溶液，定容至25 mL，混勻后，測OD595，各設置3個重復，求平均值。

1.2.8 ABTS法測漆酶酶活［16，17］漆酶酶活可以反映各WRF的木質素氧化降解能力。漆酶酶活2.5 mL反應體系：0.2 mol/L pH4.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 1 mL，0.5 mmol/L ABTS 1 mL，粗酶液 0.5 mL，對照為已進行10 min沸水浴滅活的粗酶液。加入粗酶液啟動反應，每1 min記錄OD420。

酶活計算公式：U/L=A×V×106/（eLtv）

其中，A：吸光值；V：反應體系總體積（mL）；e：摩爾吸光系數，漆酶為3.6×104（mol/L）-1cm-1；L：比色皿直徑（cm）；t：反應時間（min）；V：樣品體積（mL）。

1.2.9 DNS法測濾紙酶活［18］濾紙酶活可以反映各WRF的纖維素酶活。濾紙酶活測定反應體系：0.1 mol/L pH4.6 醋酸緩沖液 1 mL，1條 1 cm×6 cm定量濾紙，粗酶液1 mL，對照為已進行10 min沸水浴滅活的粗酶液。加入粗酶液啟動反應，緩沖液需在50℃進行預熱，準確計時反應1 h，取出后立刻加入3 mL DNS溶液，5 min沸水浴中進行滅活，冷卻至室溫后，稀釋三倍在紫外分光光度計下測定OD520。

酶活計算公式：U/mL=葡萄糖量/60×V，其中，60：保溫時間，即酶與底物作用時間（min）；V：粗酶液體積（mL）。1 U濾紙酶活定義：特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1 mmol葡萄糖的酶量。

1.2.10 木質素和纖維素含量測定 測定依照NREL LAP［19］中選用的兩步酸水解的方法對酸溶木質素及酸不溶木質素進行測定，濾液中各單糖濃度則通過離子色譜HPAEC進行測定，來評估纖維素的含量。其中纖維素的轉化率及各木質素計算公式如下：

Glu：葡萄糖濃度；M：絕干試樣質量；m：烘干后酸不溶木質素質量；D：濾液稀釋倍數；V：濾液總體積；Q：吸光系數，材料不同，吸光系數改變。

2 結果

2.1 愈創木酚培養基篩選高效白腐真菌菌株

在愈創木酚選擇培養基平板上培養11株野外分離的白腐真菌菌株10 d，對各平板的變色情況進行了觀察記錄，結果見表1。根據變色結果可將11株白腐真菌分為3種類型：（1）只生長不產生氧化降解酶類，包括以下4種：黑管孔菌 Bjerkandera adusta Dai 8222、香菇 Lentinus edodes Dai 10131、香榧嗜藍孢孔菌 Fomitiporia torreyae Dai 8180、樺附毛孔菌 Trichaptum pargamenum Dai 5896；（2）既不生長也不產生氧化降解酶類，包括以下兩種：多帶革孔菌 Coriolopsis polyzona Z3、日本多年臥孔菌Perenniporia japonica Dai 9232；（3）既生長也產生氧化降解酶類（d1/ d2＜1），包括以下5種：樺褶孔菌 Lenzites betulinus Cui 5617、鍺栓孔菌 T. ochrecea Cui6888、東方栓孔菌 T. orintalis Cui 6320、絨毛栓孔菌 T. pubescens Cui 7571、氈毛栓孔菌 T. velutina Dai 10149。

表1 11株白腐菌的寄主、采集地點及在選擇培養基上的變色結果

2.2 白腐菌生長曲線

初步篩選出的3株白腐菌氈毛栓孔菌T. velutina Dai 10149、鍺栓孔菌T. ochracea Cui 6888和絨毛栓孔菌T. pubescens Cui 7571通過重量法繪制其生長曲線，時間為橫坐標，菌體濃度為縱坐標（圖1）。由圖1可以看出，經過166 h的培養，Dai 10149 的遲緩期、對數增長期、穩定期及衰亡期分別為：0-46 h、46-70 h、70-153 h及153 -166 h；Cui 6888的遲緩期、對數增長期、穩定期及衰亡期分別為：0-41 h、41-118、118-142 h及142-166 h；Cui 7571的遲緩期、對數增長期、穩定期及衰亡期分別為：0-32 h、32-89 h、89-104 h及104-166 h。

圖1 T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888 及T. pubescens Cui 7571生長曲線

2.3 懸浮液中蛋白質含量

2.3.1 蛋白質標準曲線 如表2加入試劑后，得到蛋白質標準曲線（圖2），回歸方程為：y = 0.058x + 0.272 6，R2= 0.998 4，判定系數接近1，可以用于后續實驗。

表2 蛋白質標準曲線繪制方法

圖2 蛋白質標準曲線

2.3.2 蛋白質含量測定 粗酶液中的蛋白質主要為酶蛋白，因此蛋白質濃度的變化可以總體反應白腐菌胞外酶活的變化［16］。測定培養48 h后3種白腐真菌的蛋白質含量，隔天一測并記錄，見圖3。

圖3 T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888、T. pubescens Cui 7571蛋白質濃度的變化

2.4 胞外酶活

2.4.1 懸浮液中漆酶酶活測定 漆酶是有效降解酚類、木質素等有機化合物的重要氧化酶類，與木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶統稱為木質素降解酶。培養2 d后，對懸浮液中漆酶酶活連續測定5 d，得到圖4。

圖4 T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888、T. pubescens Cui 7571培養過程中漆酶酶活的變化

2.4.2 懸浮液中濾紙酶活測定 濾紙酶活一定程度上可以反映纖維素酶總量，纖維素酶可以將纖維素轉化為還原糖，通過發酵產生對人類有用的生物乙醇等燃料。除此以外，在紡織工業和生物工程中也有很多重要的應用。培養2 d后用DNS法測定濾紙酶活［17］，如圖5。

2.5 降解不同木質纖維素材料

根據生長速率及穩定性以及各酶活高低，可以看出T. pubescens Cui 7571是一株具有高效降解能力的菌株。因此將其分別接至魚鱗云杉、毛白楊及秸稈碎屑上，經過兩個周期的培養（每個周期10 d），利用兩步酸水解得方法對其木質素含量和纖維素含量進行測定，如表3。

圖5 T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888、T. pubescens Cui 7571培養過程中濾紙酶活的變化

表3 T. pubescens Cui 7571處理不同材料的相對組分含量

3 討論

3.1 白腐真菌的篩選

本次實驗需要在生長且產生木質素降解酶的白腐真菌類型中選取既生長茂盛又產生木質素降解酶多的菌株，因此樺褶孔菌 Lenzites betulinus Cui 5617以及東方栓孔菌 T. orintalis Cui 6320 由于生長量不足及產木質素氧化降解酶較少而被剔除；相反，鍺栓孔菌 T. ochrecea Cui 6888、絨毛栓孔菌 T. pubescens Cui 7571及氈毛栓孔菌 T. velutina Dai 10149因其具有較高的生長量以及較強的木質素降解酶而被選中研究它們的生長曲線以及胞外酶活的變化。

3.2 鍺栓孔菌、絨毛栓孔菌及氈毛栓孔菌的生長曲線、蛋白質含量與胞外酶活

從生長量來看，T. pubescens Cui 7571和T. velutina Dai 10149 的整體菌體濃度高于T. ochracea Cui 6888；而從生長速度來看，T. pubescens Cui 7571進入對數期的時間較T. velutina Dai 10149 快，且在對數生長期生長速率較快，即該時期曲線的斜率較大；從衰減速度來看，T. velutina Dai 10149 較T. pubescens Cui 7571晚進入衰減期，有較強的穩定性，但這可能受液體培養的空間與生長速度的影響，T. pubescens Cui 7571 生長速度很快，所以提前到達了群落穩定階段，受到環境的限制提早進入衰亡期。所以，提供合適的生存環境，T. pubescens Cui 7571可能具有更大的生長潛力。

對于蛋白質含量，T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888、T. pubescens Cui 7571在3 d時具有最高蛋白質濃度，分別為2.92 mg/L、3.01 mg/L、3.20 mg/L。此后均有下降趨勢，而T. pubescens Cui 7571較另外兩株白腐菌表現出較高水平的蛋白質含量，且在此后的3 d內，表現較為平穩，因此其具有較穩定的內環境。各菌體產生蛋白質的速率也是與其各自的生長規律相輔相成的。

對于漆酶，T. velutina Dai 10149在第3天達到最高值37.7 U/L后，日后呈逐步下降趨勢，不具有長期降解木質素等物質的能力，會出現隨時間增長的能力退化；T. ochracea Cui 6888和T. pubescens Cui7571則表現出較高的漆酶水平及較快的分泌漆酶能力，7 d后分別達到了51.6 U/L、111.0 U/L。白腐菌主要在其次生代謝過程中產生漆酶，次生代謝過程則一般出現在菌體生長的穩定期。

在菌體生長的對數期、穩定期以及衰亡期均會產生纖維素酶，且隨著生長量的增多，纖維素酶活也會相應的增高。T. velutina Dai 10149、T. ochracea Cui 6888 5 d后出現小高峰，濾紙酶活分別為917.7 U/L和878.3 U/L，后開始下降，穩定性較差；而T. pubescens Cui 7571則隨著培養時間的增長，其濾紙酶活呈穩定上升趨勢，且在5 d內達到最高值976.9 U/L，具有長時間培養的高效利用纖維素能力。

3.3 絨毛栓孔菌對不同材料的降解

對于針葉植物魚鱗云杉木質纖維素材料的降解，T. pubescens Cui 7571在10 d內對酸溶木質素的降解較多，在隨后的10 d內則主要降解酸不溶木質素，可以看到具有較高的木素降解能力，酸不溶木素的相對含量在20 d僅有20.90%，在此期間纖維素也被部分利用；對于闊葉植物毛白楊木質纖維素的降解，降解模式與魚鱗云杉基本相似，但對于毛白楊木屑的纖維素利用率并不高，這可能與不能較高的除掉該材料木質素屏障有關；對于單子葉草本植物玉米秸稈的降解，在10 d內并沒有較大的變化，在隨后的10 d也先表現出對酸溶木質素的較快降解，期間對纖維素的利用率較低。

4 結論

絨毛栓孔菌T. pubescens Cui 7571具有很強的生長能力及胞外酶活分泌能力；且對單子葉植物和雙子葉植物，針葉植物及闊葉植物的木質纖維素材料均具有較強的降解能力。

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（責任編輯 李楠）

A Study on the Degradation Capacity of Several Non-model White-rot Fungi

Wu Xuejun Cui Baokai
（Institute of Microbiology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Based on testing of guaiacol selective medium， 3 isolates from 11 white-rot fungi were selected， and they are Trametes velutina Dai 10149， T. ochracea Cui 6888 and T. pubescens Cui 7571. Then growth curve of the 3 isolates based on weight method were plotted， and the changes of protein content and two extracellular enzyme activities were monitored. The results showed that T. pubescens Cui 7571 had excellent ability of growth， and stable and outstanding ability of secreting cellulase and laccase. It can significantly decompose the lignocelluloses in conifer， hardwood and monocotyledon plants.

white-rot fungi；growth curve；extracellular enzyme activity；chemical composition content；degradation capacity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.024

2014-10-16

吳雪君，女，碩士，研究方向：森林病理學；E-mail：xuejunw293@163.com

崔寶凱，男，教授，研究方向：菌物系統學；E-mail：baokaicui@yahoo.com.cn