十個濃香型大曲揮發性風味物質的主成分分析

姚霞，明紅梅，周健，陳曉旭，陳蒙恩，朱莉莉

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

十個濃香型大曲揮發性風味物質的主成分分析

姚霞，明紅梅*，周健，陳曉旭，陳蒙恩，朱莉莉

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

研究濃香型大曲的主要揮發性風味物質，并根據這些化合物對大曲風味做初步評定，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（SPME-GC-MS）技術檢測大曲中的揮發性物質，用乙酸丁酯作為內標物，半定量這些化合物的含量，并用主成分分析法對揮發性物質和大曲樣進行分析。結果顯示：從10個大曲樣品檢測出46種揮發性風味物質，主要以酯類、吡嗪類、芳香類為主；主要的揮發性化合物是2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪等；對10個大曲樣本進行主成份分析，6號樣風味最好，10號樣其次，1號風味最差。通過對大曲中主要揮發性風味物質研究，可為大曲風味質量判斷提供一定的理論參考價值。

濃香型大曲；揮發性風味物質；頂空固相微萃取；氣質聯用；主成分分析

大曲是釀制大曲酒用的糖化劑、發酵劑和增香劑［1-3］，含有多種微生物及產生的多種酶類，降解的原料成分和微生物代謝產物直接或間接地構成了白酒的風味物質［4］，像氨基酸類、芳香族類等物質為白酒的香味呈現起著重要作用［5］，對曲酒的風味和口感都有極大的影響。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（SPME-GCMS）是研究復雜體系揮發性物質的一項實用技術［6］，廣泛被一些專家學者用于大曲、食品、藥材等揮發性風味物質的檢測［7-9］。本研究對選取的10個濃香型大曲樣本先進行頂空固相微萃取，在氣質聯用儀上進行解析檢測大曲中的揮發性風味物質，并對這些揮發性風味物質進行半定量分析，利用主成分分析法對檢測的揮發性風味物質和10個濃香型大曲樣本分別進行分析，對本次大曲樣中的主要揮發性風味物質給以確認，也對這10個大曲樣進行評價。這對研究大曲乃至大曲酒中風味物質提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

大曲樣品：瀘州老窖制曲生態園提供。由有經驗的工人在一批成曲中幫忙挑選10塊大曲，編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別粉碎過40目篩，混合均勻，存入4℃冰箱保存備用。

50 μm/30 μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭、手動SPME進樣器、15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶：美國Supelco公司；Agligent 6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；KQ-500DE型超聲波振蕩儀：昆山市超生儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1頂空固相微萃取（SPME）條件

選取50μm/30μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭，第一次使用時需于氣相色譜進樣口230℃老化5 min。

樣品處理：取3g樣品和10μL內標溶液放入頂空瓶中，蓋上瓶蓋，60℃水浴超聲波震蕩儀中平衡15min，然后插入萃取頭，再60℃水浴頂空萃取30 min；GCMS進樣口解吸4 min，進行GC-MS分析。

1.2.2氣相色譜-質譜（GC-MS）分析條件

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX，規格為（60 m×250 μm×0.25 μm）；手動無分流進樣，進樣口溫度230℃；程序升溫：40℃保持1 min，然后5℃/min升溫到180℃，保持1 min，再8℃/min升溫到230℃，保持7 min；載氣：高純度氦氣，流速為1 mL/min。

質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質量掃描范圍20 u～550 u，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

1.2.3定性與半定量分析

定性：檢出揮發性組分物質的質譜圖，通過與標準譜庫（NIST05a.L）對比鑒定，匹配度大于800的予以確認。

半定量：選擇乙酸丁酯為內標，乙醇為溶劑，配制乙酸丁酯濃度為1.76×10-5g/mL，取10 μL與3 g樣品混勻，再進行頂空固相微萃取。先將大曲樣品中鑒定的化合物質的峰面積與乙酸丁酯峰面積之比來初步判斷這些揮發性化合物的含量，再根據乙酸丁酯質量濃度來進一步計算這些揮發性化合物的含量［12］，由于沒有多次重復實驗，對揮發性香味物質定量分析為本次萃取條件下的相對含量，故稱半定量。

1.3數據處理方法

采用主成分分析法確定貢獻率較大的香味成分［10］。主成分分析法把原來眾多具有一定相關的多個指標（比如P個指標）重新組合成一組新的互相無關的綜合指標來代替原來的指標，使復雜的問題簡單化，便于抓住主要矛盾進行分析［11-13］。

將香味成分數據錄入SPSS19.0根據相關系數列出相關矩陣，求出特征根及其相應的特征向量，從特征根中選出幾個較大的特征根及其特征向量，累積貢獻率在80%以上的前幾個成分作為主成分進行分析［14-15］，找出主要貢獻的揮發性風味物質。

2結果與分析

2.1十個大曲樣品揮發性風味物質分析

十個大曲樣品揮發性風味物質通過計算機譜庫查詢，并結合相關文獻［8-10，15］檢索，共檢出46種揮發性風味物質，分七類，其中醇類2種、酸類1種、醛類2種、烯類5種、吡嗪類11種、酯類16種、芳香類9種。大曲樣品中的揮發性風味物質種類及含量，如表1所示，不同的大曲樣品檢測的揮發性風味物質的種類和含量有一定差別，6、10號樣品檢測到的最多，3號樣其次，1號樣品最少。

表1　大曲樣品中揮發性風味物質成分及含量Table 1The volatiles flavor compositions and their cotents in Daqu sample

續表1大曲樣品中揮發性風味物質成分及含量Continue table 1The volatiles flavor compositions and their cotents in Daqu sample

2.2十個大曲樣品揮發性風味物質主成分分析

利用軟件SPSS19.0對10個大曲樣品的46種揮發性風味物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。得到主成分的特征值和貢獻率如表2，主成份分析碎石圖如圖1，主成分載荷矩陣如表3。

主成份確定一般根據因子的累計貢獻率、特征值以及碎石圖拐點的變化趨勢等因素來確定［11］。根據表2，前四個主成分特征值分別為24.661、7.037、4.004、2.843均大于1，方差貢獻率分別為53.612%、15.298%、8.704%、6.180%，其累計貢獻率達到83.794%，根據主成分分析一般提取主成分包含80%以上信息原理，前四個主成分包含了46種揮發性香味物質的絕大部分信息；根據圖1，前四個主成分折線趨勢很陡，在第五個主成分開始折線開始變的平緩；因此取前四個主成分說明46種揮發性香味物質的變化趨勢，根據貢獻率的大小，依次定為第一、第二、第三、第四主成分。

表2　主成分的特征值及其貢獻率Table 2Eigenvalues contribution and cumulative contribution of principal components

圖1　主成分分析碎石圖Fig.1The principal component analysis scree plot

表3　主成分載荷矩陣Table 3The principal component loading matrix

續表3主成分載荷矩陣Continue table 3The principal component loading matrix

由表3可知，第一主成分反映的指標主要有2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯基丙酮、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、月桂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、萘、環辛烯、十五酸乙酯、丁酸乙酯、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、辛酸乙酯、苯甲醛、2，6-二乙基吡嗪、異丁酸、2-甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯，主要指向吡嗪類、酯類、芳香類物質；第二主成分反映的指標主要有1-十一烯、苯乙醇、E-11-十六烯酸乙酯、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪，主要指向吡嗪類、芳香類物質；第三主成分反映的指標主要有乙醛、2-丁烯醛、苯酚，主要指向醛類、芳香類物質；第四主成分反映的指標主要有正丁醇、1，2，4-三甲氧基苯，主要指向醇類、芳香類物質。因此可以初步判斷以上揮發性風味物質為大曲的主要風味物質，主要指向吡嗪類、酯類、芳香類物質。

圖2由10個大曲樣的第一主成分為橫坐標，第二主成分為縱坐標做散點圖而得。

由圖2可知，10個大曲樣本可分為5簇，6號樣和其他樣品分開比較遠，單獨成一簇，命為1簇；2、3、5、10號樣比較接近，可分為一簇，命為2簇；7、8號樣比較接近，命為3簇；4、9號樣比較接近命為4簇；1號樣單獨為一簇，命為5簇。

圖2　10個樣品的主成分散點圖Fig.2PCA biplot for 10 samples

圖3　46種香氣物質主成分散點圖Fig.3PCA biplot for 46 identified aroma components

圖3由46種揮發性香味物質的第一主成分值為橫坐標，第二主成分值為縱坐標（第一、第二主成分累計貢獻率達68.910%）做散點圖而得。綜合圖2、圖3可知，影響1簇即6號樣品的風味物質主要集中在第一象限，離原點較遠的位置，按影響力大小依次為己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、二甲基吡嗪、月桂酸乙酯、油酸乙酯、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、2，3-二甲基吡嗪、辛酸乙酯等；影響2簇樣品的風味物質也集中在第一象限，離原點較近的位置，按影響力大小依次為（E，E，E）-1，4，8-十二碳三烯、苯酚、2，6-二甲基吡嗪等；影響3簇樣品的風味物質集中在第一主成分的負半軸，主要影響物質為E-1，9-十四碳二烯；影響4簇的風味物質主要集中在第二成分的負半軸，主要影響物質為正丁醇；影響5簇的風味物質主要集中在第三象限，主要影響物質為2，3-二甲基-5-乙基吡嗪。

以每個主成分所對應的特征值占所提取的主成分總的特征值之和的比例作為權重，計算主成分綜合得分，即F值，再根據F值大小對10個大曲樣進行排序，如表4所示，綜合得分越高說明大曲風味越好，如此可以對大曲風味進行評定，繼而分級。

表410　個大曲樣綜合評價結果Table 4The comprehensive evaluation results of 10 Daqu samples

根據表4可知，6號大曲樣得分最高，風味最好，其次是10號樣大曲，再其次是3號大曲樣，得分最低的是1號樣，即1號樣大曲風味最差。

3結論

利用頂空固相微萃取，結合氣相色譜質譜法（GCMS）測定10個大曲樣品中的揮發性風味物質成分，共檢測出揮發性風味物質46種，包含酯類化合物，吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類化合物、烯類化合物、醇類化合物、酸類化合物。同時利用內標法對這些風味成分進行半定量分析，發現酯類物質、吡嗪類物質、芳香族類物質含量比較高。

對檢測出的46種揮發性風味物質進行主成分分析，發現2，3，5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2，5-二甲基吡嗪、棕櫚酸乙酯、2，3，5，6-四甲基吡嗪、苯基丙酮、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、月桂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、1-十一烯、苯乙醇為大曲的主要揮發性風味物質。對10個大曲樣本進行主成份分析，6號樣得分最高，風味最好，10號樣其次，1號樣品得分最少，風味最差。

本研究對10個大曲樣本的揮發性風味物質進行萃取分析，利用主成分分析法分析大曲風味，為大曲風味質量的判斷提供了一種新的方法。

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Principal Components Analysis of Volatile Flavor Components from Ten Luzhou-flavor Daqu

YAO Xia，MING Hong-mei*，ZHOU Jian，CHEN Xiao-xu，CHEN Meng-en，ZHU Li-li
（Sichuan University of Science&Engineering of Bioengineering Institute，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to study the main volatile flavor substances in Luzhou-flavor Daqu and do the primary evaluation on Daqu level of flavor according to these compounds，headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography mass spectrometry（SPME-GC-MS）detection method was used，and using butyl acetate as the internal standard substance，semi quantitative the content of volatile compounds，analyze the compounds and Daqu samples by principal component analysis（PCA）.The results showed that：there were 46 kinds of volatile flavor substances detected in 10 Daqu samples，mainly contend esters，pyrazines，aromatic. Volatile flavour compounds mainly contend trimethyl-Pyrazine，Tetradecanoic acid ethyl ester，1-Phenyl-2-propanol，2，5-dimethyl-Pyrazine，Hexadecanoic acid ethyl ester，tetramethyl-pyrazine and so on.Analyze 10 Daqu samples by PCA，the flavor of the best was sample 6，secondly was sample 10，No.1 had the worst flavor. Through the research on the main volatile flavor compounds of Daqu，it could provide some theory reference value for Daqu quality judgment.

Luzhou-flavor Daqu；volatile flavor components；headspace solid phase micro-extraction，gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）；principal component analysis（PCA）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.005

2015-05-09

瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk04）；研究生創新基金項目（y2014028）

姚霞（1988—），女（漢），在讀研究生，研究方向：釀酒微生物研究及應用。

明紅梅（1971—），女，副教授，從事釀酒微生物研究。