固相萃取-高效液相色譜法測定角膜接觸鏡護理液中聚氨丙基雙胍

北京市醫療器械檢驗所（101111）劉曦 崔永平

1 引言

雙胍類物質是一種對細菌和病毒有較強殺滅作用的殺毒劑，其具有廣譜抗菌、低濃度高效能、對眼睛和皮膚低刺激等特點，廣泛應用于工業、農業、食品、醫療和個人護理等領域。目前，聚氨丙基雙胍（PAPB）常用于角膜接觸鏡護理液中，該類護理液對角膜接觸鏡的殺菌消毒和抑制致病微生物的作用完全符合GB 19192-2003和YY 0719.3-2009的要求[1][2][3][4][5]。PAPB在角膜接觸鏡護理液中的含量約為1μg/mL，含量過低達不到殺菌效果；過高則會在接觸鏡上聚集對角膜或眼部其它組織產生刺激或傷害[6]。因此，衛生部規定消毒劑中有效成分的準確測定是檢查消毒劑質量的基本措施之一；YY 0719.2-2009中也強制性要求接觸鏡護理產品應符合制造商標示的主要有效成分含量范圍[7][8]。但行業標準中并未規定檢驗方法，國內外也鮮見相關方法學研究報告。鑒于此，本文利用Sep-Pak固相萃取柱對樣品中PAPB進行富集，去除樣品中基線噪音和雜質峰的干擾，采用液相色譜法建立角膜接觸鏡護理液中PAPB的測定方法，為此類產品的風險控制、安全性評價和行業標準的完善提供依據。

附表1 加標回收率實驗結果

附表2 樣品含量測定結果

附圖1 PAPB標準工作液高效液相色譜圖

附圖2 相似濃度的PAPB標準工作液與樣品檢驗液的高效液相色譜圖

2 材料與方法

2.1 試劑與樣品 磷酸（北京化學試劑廠，優級純），鹽酸（北京化學試劑廠，優級純），己烷磺酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，純度：99.0%），氫氧化鈉（北京化學試劑廠，分析純），四硼酸鈉（北京化學試劑廠，分析純），硼酸（西隴化工股份有限公司，分析純），三乙胺鹽酸鹽（天津市光復精細化工有限公司，純度：99.00%～100.5%），氯化鈉（北京化學試劑廠，分析純），甲醇（Fisher Scientific，HPLC Grade），PAPB對照品（批號：4/30/2014，純度：98.9%），角膜接觸鏡護理液（批號：A131008，凈含量：500mL）。

2.2 儀器設備 高效液相色譜儀（Waters，1525），固相萃取真空裝置（CNW，SBEQ-CR1012），真空泵（Autoscience），固相萃取柱（Waters，Sep-Pak），電子天平（梅特勒-托利多，XP205DR），超純水機（Millipore，Milli-Q A10），0.45μm尼龍過濾膜（Memebrane Solution），0.45μm尼龍針式過濾器（Merck Millipore）。

2.3 色譜條件 S U P E L C O S I L C8（5 c m×4.6 m m，5 μ m）色譜柱；進樣量100μL；流速0.5mL/min；流動相A[0.2mmol/L己烷磺酸鈉水溶液-甲醇（V/V=1:1），0.45μm過濾膜過濾，用磷酸和1mol/L氫氧化鈉調節pH=（3.1±0.05）]和流動相B[1mmol/L氯化鈉-7.5mmol/L三乙胺鹽酸鹽混合水溶液-甲醇（V/V=1:9），0.45μm過濾膜過濾，用磷酸和1mol/L氫氧化鈉調節pH=（3.1±0.05）]；梯度洗脫[流動相B（0～8）min，流動相A（8～17）min]；紫外檢測波長235nm；柱溫25℃。

2.4 PAPB標準儲備液的制備 精密稱量0.0257g PAPB對照品，用0.01mol/L鹽酸溶解并定容至50mL得到51.4μg/mL PAPB標準儲備液。

2.5 樣品檢驗液的制備 固相萃取柱先用4mL甲醇活化，再用4mL硼酸鹽緩沖液（0.2mmol/mL硼酸-0.005mmol/mL硼酸鈉-0.2mmol/mL氯化鈉混合水溶液，0.45μm過濾膜過濾，用1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調節pH值7.1～7.4）沖洗；然后用固相萃取真空裝置慢速富集20mL樣品，用4mL高純水淋洗至真空抽干；最后用4mL 0.1mol/L鹽酸洗脫，0.45μm針式過濾器過濾得到樣品檢驗液。

3 結果與討論

3.1 系統適應性 用0.1mol/L鹽酸將PAPB標準儲備液稀釋成一定濃度的標準工作液，按照2.3色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，分析本研究中色譜條件對PAPB的系統適應性，結果表明理論塔板數約為4000，PAPB與相鄰共存物的分離度為2.2，拖尾因子為1.03。色譜圖見附圖1。

3.2 樣品的富集 角膜接觸鏡護理液中PAPB含量約為1μg/mL，在2.3色譜條件下直接進樣測定，PAPB信號響應值（峰高）較低，基線噪音、雜質峰或者相鄰共存物等因素的干擾會降低定量的準確性，故采用固相萃取對樣品進行2.5中的富集-洗脫，得到樣品檢驗液。

另外，本研究中考慮到對樣品進行富集-洗脫后，可能引入的新物質、新雜質對PAPB色譜峰保留時間的影響，造成PAPB標準工作液無法直接用于外標法定量，而也需要進行2.5中的富集-洗脫，故按照2.3色譜條件，分別對相似濃度的PAPB標準工作液與樣品檢驗液進樣，液相色譜圖顯示并無明顯差異，見附圖2。結果表明PAPB標準工作液無需進行富集-洗脫，即可用于外標法定量的標準曲線制備。

3.3 標準曲線 用0.1mol/L鹽酸逐級稀釋PAPB標準儲備液得到2.57μg/mL～25.7μg/mL的PAPB標準工作液。將上述標準工作液按照2.3色譜條件進樣測定，得到PAPB含量對應的峰面積，以峰面積（y）為縱坐標，含量（x，μg/mL）為橫坐標，線性回歸。結果表明PAPB在濃度2.57μg/mL～25.7μg/mL范圍內與峰面積保持良好的線性關系，線性回歸方程為y=470000x-103000，相關系數為r=0.9999。

3.4 靈敏度 將PAPB標準儲備液逐級稀釋，按照2.3色譜條件進樣測定，當信噪比（S/N）=3時，本方法檢出限為0.514μg/mL。

3.5 精密度 取一定濃度的PAPB標準工作液，按照2.3色譜條件連續進樣5次，得到PAPB峰面積，計算其變異系數（RSD）為1.1%（n=5），表明本方法精密度良好。

3.6 加標回收率 精密量取已知PAPB含量（1.295μg/mL）的樣品20mL，共6份；分別精密加入PAPB標準儲備液（51.4μg/mL）適量，按照2.5制備檢驗液，按照2.3色譜條件進樣測定檢驗液中PAPB含量，并計算回收率，結果見附表1。

3.7 樣品含量測定 按照2.5制備樣品檢驗液，按照2.3色譜條件進樣測定，按外標法計算樣品中PAPB含量，結果見附表2。

4 結論 本研究表明，固相萃取-高效液相色譜法用于角膜接觸鏡護理液中聚氨丙基雙胍含量的測定，具有良好的線性范圍、重復性好、準確度高、易于操作和推廣，能為此類產品的風險控制和行業標準的制修訂提供技術依據。