冠心病心絞痛標志物的液質非標記篩查比較

苗 蘭曹進,2* 孫明謙林 力張 穎劉建勛

（1 中國中醫科學院西苑醫院，基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京100091；2 中國食品藥品檢定研究院，食品化妝品檢定所，北京100050）

冠心病心絞痛標志物的液質非標記篩查比較

苗 蘭1曹進1,2* 孫明謙1林 力1張 穎1劉建勛1

（1 中國中醫科學院西苑醫院，基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京100091；2 中國食品藥品檢定研究院，食品化妝品檢定所，北京100050）

目的 通過非標記技術對血清中心絞痛蛋白標志物進行篩查。方法 利用液相色譜質譜技術進行血清中蛋白酶解產物的分離測定，分別測定健康組、疾病零點（0時點）和兩周三組的樣本，通過蛋白搜索比較獲得相關結果。結果 健康組、0時點、2周的總蛋白數分別為466個、449個、483個，共有蛋白319個，比較發現血清蛋白組的差異不僅表現在蛋白種類的不同，還在于共有蛋白在整個蛋白組中的分布和相對含量的差異，通過相對量的比較，存在18個主要差異蛋白，其中13個蛋白呈上調趨勢，5個呈下調趨勢。結論 在疾病發生過程中，主要的蛋白變化多與心臟損傷方面的過程相關，隨著疾病進程，由于自身適應的作用，有部分與修復相關的蛋白有明顯的變化，該結果可以為心絞痛潛在標志物的選擇提供數據基礎。

非標記；蛋白組；液相色譜質譜；心絞痛

傳統的心血管疾病長期依賴于流行病學研究來鑒別和判斷疾病產生中診斷性和預測性的風險因素，如高血脂、高血壓、精神壓力等。在臨床診斷中主要依靠對患者的一些病理生理及生化檢查結果進行疾病的判斷。20世紀90年代末，針對冠心病中比較常見的臨床分型，部分內源性標志物的測定就被納入國外一些診斷標準[1]中來輔助診斷疾病，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子α等做為急性冠狀動脈綜合征前炎癥階段的輔助診斷標志物。但是對于心肌梗死早期，心肌梗死預測等的標志物還處于研究和未知階段，特別對于低含量的蛋白，代謝物和肽尚處于發現鑒別階段，對于心肌梗死的潛在早期（2 h以內）診斷標志物發現仍是心肌梗死診療研究的熱點[2-5]。

作為理想的心肌梗死標志物在針對性低成本篩查中必須具備高的靈敏度、專屬性和相關癥狀正面的預測性。標志物本身可以顯示疾病和健康的特征，包括表達水平、相關環境因子的種類、遺傳性質、遺傳反映、臨床顯證或者不顯證的標記、病因及對治療的反應等。因此，標志物是疾病特性，狀態及發展速度的指針。

自蛋白質組學發展以來，心臟病標志物的研究主要是針對血清樣本的研究[6-8]，通過應用二維凝膠技術和質譜的蛋白鑒別發現了一些標志物，然而，這種技術方法本身的一些局限性，如靈敏度、重復性及動態范圍等，影響了其被廣泛應用。近年來，Yates等[9]提供了一種利用譜圖的累積計數來鑒別蛋白的非標記方法，由于其在技術上克服了同位素標簽技術操作復雜、數據分析耗時的缺點，因而，這種研究技術逐漸成為研究的主流方向。針對非標記的LC/MS組學技術一個主要的問題是組織的異常復雜影響了豐度結果可鑒別程度，因此，準確、簡便、系統、規范的樣品預處理過程是整個分析測定的基礎。在本研究中，我們應用非標記液相色譜/質譜聯用技術，以冠心病心絞痛顯證患者血清樣品為研究對象，應用建立的一整套蛋白處理、蛋白組分析、鑒定等優化流程[10]，對冠心病心絞痛發展的不同時點的血清樣本進行蛋白質組學的比較研究，從整體、微觀層次動態的研究冠心病心絞痛特有蛋白質的表達，尋找冠心病心絞痛相關的差異標志物，以幫助臨床治療對于疾病進程的判斷。

1　材料與方法

圖1　人健康組與疾病組血清蛋白組PLS-DA（左圖）和OPLS-DA（右圖）圖（紅色：健康組；藍色：疾病0時點；紫色：疾病2周）

圖2　檢出蛋白所涉及的生物學過程和分子功能（左圖：生物學過程；右圖：分子功能）

1.1儀器與試劑。儀器：質譜儀（Agilent，6520 Q-TOF，Chip-ESI源）；納升級液相色譜（Agilent 1200，Chip），色譜工作站（Agilent，USA）；電子分析天平（METTLER TOLEDO AE240）；注射泵（KD Scientific公司，KDS100CE）；蛋白芯片Chip C18，150 mm×75 μm（Agilent，USA）。試劑：三羥甲基氨基甲烷Tris（amresco公司，批號2118B172），TCEP（Thermo公司，批號KG133033）、胰蛋白酶Trypsin（Thermo公司，批號KG133767），乙腈（Fisher，批號138939）、丙酮（J.T.Braker公司，批號G43E31），均為色譜純，甲酸（J.T.Braker公司，批號1K2732），為分析純，實驗用水（娃哈哈純凈水，批號201311281117GQ）。

1.2臨床樣本收集與樣本處理。樣品的收集：依據臨床實驗采集方案，選取30例健康人，30例顯證冠心病心絞痛患者，自患者和健康人入組后采集一次靜脈血液（0時點），2周后再采集一次（進行自身對比，2周）。每次取血5 mL，4 ℃放置30 min，離心15 min（3500 r/min，4 ℃），取上清，-80 ℃保存。應用BCA法測定蛋白濃度。樣本處理：吸取50 μL血清，加入3倍體積Tris緩沖液（50 mmol/L），渦旋1 min，加入3倍體積預冷丙酮，渦旋1 min，4 ℃沉淀過夜，離心15 min（8000 r/min，4 ℃），棄上清，使沉淀中的丙酮揮發完全。

1.3蛋白酶解：將提取的蛋白混懸于50 mmol/L tris緩沖液中（pH 8.5），蛋白濃度約1～3 mg/mL；活化胰蛋白酶（Trypsin）（50 mmol/L tris溶液），以20∶1的比例加入酶液，37 ℃水浴3 h，每1 h渦旋1次；加入1 mmol/L TCEP，37 ℃水浴30 min，放冷至室溫；每10 μg蛋白加入3 μL IAA溶液進行烷基化，37 ℃水浴20 min（避光）；以30∶1的比例加入酶液，37 ℃水浴過夜；每50 μL溶液加入2 μL甲酸終止反應；離心15 min（12000 r/min，4 ℃），取上清進行分析。

1.4質譜與色譜條件。質譜參數設置，源：ESI-Chip；陽離子模式；毛細管電壓：-1900 V；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流量：3.5 L/min；碎裂電壓：200 V；錐孔電壓：75 V；射頻電壓：700 V；質量范圍：300～1700 m/z；MS/MS 碎裂放大電壓：1 V；離子排除：7個前體離子；排除時間30 s。

色譜條件：蛋白芯片：150 mm 300A C18chipw/160nL富集柱；進樣量：0.5 μL；泵1（納升泵）流動相：A相：97%水，3%乙腈，0.1%甲酸；B相：90%乙腈，10%水，0.1%甲酸；流速：0.3 μL/min；線性梯度洗脫時間：B相0～70 min，3%～45%；70～85 min，45%～90%；85～95.01 min，90%～100%；95.01～110 min，100%；110～115 min，100%～3%；115～125 min，3%；運行時間：125 min。泵2（毛細泵）流動相：A相：0.1%甲酸水溶液；B相：90%乙腈，10%水，0.1%甲酸；流速：3 μL/min；線性梯度洗脫時間：B相0～4 min，0%；4～5 min，0%～80%；5～10 min，80%；10.01～85 min，80%，流速0 μL/min；85.01～95 min，80%～100%，流速3 μL/min，95～96 min， 100%～0%；運行時間：125 min。

1.5數據檢索與分析：應用Agilent DataAnalysis軟件進行圖譜分析；應用Excel2010及SPSS12.0統計分析軟件進行數據的統計學分析。蛋白檢索應用的是Agilent Spectrum Mill軟件。參數設置：數據庫種類：Swissprot；種屬：Homo sapiens；消化：Trypsin（胰酶）；最大酶切偏差：1；固定修飾：Carbamidomethylation（C）；前體質量數偏差：+/-20 ppm；產物質量偏差：+/-50 ppm；多肽過濾得分＞6，SPI（峰豐度）＞50%；蛋白過濾得分＞9。

1.6蛋白相對定量和功能聚類分析：應用scaffold3.0軟件進行蛋白相對定量、差異分析及蛋白功能聚類分析。在進行蛋白相對定量時，要求肽段鑒定的可能性＞95%，蛋白鑒定的可能性＞99%，且匹配肽段2個以上，假陽性率＜0.01%。相對定量的原理是累計譜圖計數，即利用鑒定到的二級質譜圖總數評價特定蛋白的豐度，對不同分組中的同一蛋白所檢測到的二級譜圖的個數進行歸一化，再比較蛋白的相對豐度。統計學方法應用的是ANOVA Test方法。同時應用軟件中GO注釋的功能進行蛋白質功能聚類分析。

2　結果與討論

2.1冠心病心絞痛患者血清整體蛋白的發現：通過應用非標記LC-MS技術進行冠心病心絞痛不同時期（0時點，2周）與健康組血清蛋白組的檢測，結合軟件進行搜索比對和分析，最終比對出健康組、0時點、2周的總蛋白數分別為466個、449個、483個，共有蛋白319個。對于共有的319個蛋白利用累積計數的方式，進行相對量比較，表達量下降的蛋白，下降比例均小于7倍，而表達量上升的部分蛋白，表達量變化差異可達62倍。

結果顯示隨著疾病的進程，疾病與正常人群之間蛋白組在量上存在較大的差異，在疾病發病后，疾病相關的部分蛋白組存在上調的趨勢，同時根據疾病進程，存在進一步擴展的趨勢。

2.2血清蛋白組最小二乘法與偏最小二乘法分析：針對最終檢索出的蛋白，應用SIMCA P+12.0軟件進行組學數據的聚類和預測分析。以健康組為參照，對另2組（0點和2周）疾病來源樣品進行了最小二乘法（PLS-DA）和偏最小二乘法（OPLS-DA）分析，將上述各組進行分類。見圖1，兩圖均顯示健康組和疾病組（0點，2周）區分較為明顯，表明疾病組和健康組變化差異較大；而疾病0點和2周的數據點不能明顯區分開來，具體走勢不明顯，表示疾病0點和2周疾病發展變化可能不大。

2.3蛋白功能分析：本研究針對檢測到的蛋白相關的生物學過程和分子功能進行聚類分析。見圖2所示，鑒定到的蛋白涉及的生物學過程主要是應激反應、生物調控反應、代謝過程、細胞過程、免疫系統過程等；其涉及的功能主要是分子信號轉導活性、結合功能、酶調控活性、分子功能及催化活性等。分析結果顯示的主要生物學過程和分子功能與心絞痛的發生、發展有著密切的關系，也與之前的研究結果一致。

2.4差異蛋白及其功能分析：本研究中應用非標記的蛋白質組學方法，結合Scaffold軟件進行蛋白相對定量分析，根據蛋白整體的含量水平差異，蛋白差異變化在10倍以上的被視為差異蛋白。經比較分析發現的差異蛋白18個，與正常組比較，疾病組中有13個蛋白上調，有5個蛋白下調，這些差異蛋白多與炎性反應、血栓形成、動脈粥樣斑塊、缺血/再灌損傷及血小板功能等方面相關。

在上述差異蛋白中，表達量上調的蛋白其功能主要與介導炎性反應、動脈血栓形成、調節血管再生、調節內皮細胞黏附及血小板凝集等過程相關。這些來自炎癥、心肌缺血或心臟病相關的蛋白，在急性心肌梗死、心阻甚至慢性缺血的情況下，會引起一系列炎性因子的釋放，同時細胞黏附分子激活，能夠進一步使血管收縮狹窄，引起血管的堵塞，造成心肌缺血。C-反應蛋白是已知的、公認的急性炎性反應期的臨床診斷標志物，能夠反映心血管疾病發生發展的不同階段。其次，這些調節血管再生和凝血蛋白能夠直接影響心絞痛的發生、發展與轉歸，如在慢性心肌缺血狀態下，發生血管再生能夠暫時緩解心肌缺血的癥狀，為進一步治療贏得時間，隨著導致心肌缺血的原因消除，血管心臟功能漸趨好轉，但是如果病情日漸惡化，主干血管發生嚴重堵塞，血管再生根本無法滿足心臟的供血需求，最終導致心衰。因此，炎性反應的發生、血栓的形成、動脈粥樣斑塊的形成、細胞的黏附、血管的調節等均是心絞痛發生發展的影響因素，或者說是始動因素，可以間接或者直接導致心絞痛的發生和發展。

而在表達量下調的蛋白中主要是生長與分化相關蛋白、心臟重塑相關蛋白及心肌肥大相關蛋白等，說明心臟發生缺血后會啟動代償機制，觸發自我修復的能力，只是根據患者的身體狀況和疾病發展的不同進程，其代償能力、自我修復能力及修復程度不同。該類蛋白隨著血液循環接觸相關細胞，對細胞的生長過程產生影響，如類胰島素樣生長因子（IGF-1），是一類多功能細胞增殖調控因子，其結構與胰島素結構相似，可以觸發與胰島素相似的細胞反應，包括細胞的分化、增殖。

2.5結論：本研究應用非標記LC-MS方法對心絞痛疾病和健康人的臨床血清樣本進行蛋白質組分析比較，通過檢測、數據比對以及相對定量分析，發現了18個與疾病相關的主要差異蛋白，其中13個蛋白存在上調的趨勢，這些上調蛋白根據主要的功能集中在炎癥、心肌缺血或心臟疾病標志物、血管蛋白；而5個下調的差異蛋白主要是心衰與重塑相關蛋白，說明在心絞痛發展的進程中，存在自身的調節，以彌補來自炎癥或者缺血帶來的心臟損傷。

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Markers Screening on Coronary Heart Disease Angina Pectoris by Label free Liquid Chromatography Mass Spectrometry

MIAO Lan1, CAO Jin1,2, SUN Ming-qian1, LIN Li1, ZHANG Ying1,Liu Jian-xun1
(1 Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology, Beijing 100091, China; 2 National Institute of Food and Drug Control, Institute for Food and Cosmetics Control, Beijing 100050, China)

Objective To screen protein markers of angina pectoris in serum by label free technology. Method Liquid chromatography mass spectrometry was performed to separate and detect the digestion products in three groups’s ample, which were healthy, disease zero point(0 week), and two weeks point(2 weeks). The comparison results were achieved by database searching. Results The total proteins in three groups, healthy, disease zero point(0 week), and two weeks point(2 weeks), were 466, 449, and 483, respectively. The common proteins were 319. The difference between serum proteome in different groups was not manifested around the types of protein but in distribution and relative amount across proteome. With the comparison of relative amount, 13 proteins were presented in uptrend as well as 5 in down trend. Conclusion The results shown the difference proteins in serum were varied with the process of cardiac trauma. Along the development of disease， proteins related with repair had been varied significantly through self adaptive. The results could provide the basis data for potential biomarkers option on angina pectoris

Label free; Proteome; Liquid chromatography mass spectrometry; Angina pectoris

R541.4

B

1671-8194（2015）36-0004-03

科技部國際合作項目（2011DFA31440）；中國中醫科學院西苑醫院苗圃課題（XYKY-MP（2013）-34）；北京市科技專項（z121107002812036）