豬瘟活疫苗耐熱保護劑冷凍干燥技術研究

王春偉，葉勝丹

（浙江諾倍威生物技術有限公司，浙江杭州　310018 ）

豬瘟活疫苗耐熱保護劑冷凍干燥技術研究

王春偉，葉勝丹

（浙江諾倍威生物技術有限公司，浙江杭州310018 ）

隨著豬瘟活疫苗耐熱保護劑的不斷應用，凍干技術的要求也越來越高。通過對凍干工藝的不斷研究，采取預凍階段快速和慢速降溫，一期升華階段選取不同溫度等方法，篩選一條合適的凍干曲線，不僅縮短凍干時間，降低生產能耗，而且有利產品質量穩定，為今后耐熱保護劑的冷凍干燥提供了研究方向。

冷凍干燥；豬瘟活疫苗；耐熱保護劑；凍干曲線

我國于1955年成功研制了豬瘟兔化弱毒疫苗，并于1958年成功研制出了凍干疫苗，以適用于批量生產［1］。在獸用生物制品冷凍干燥過程中不僅需要一定量的抗原，而且還需要添加一些成分作為凍干保護劑。凍干保護劑不僅要具有保護制品生物學活性的作用，而且要具有維持制品有一定形狀、抗氧化的作用，其直接與疫苗的質量和長期保存保持穩定性相關聯［2］。我國現在常用的獸醫生物制品保護劑主要用脫脂奶粉和蔗糖進行配制，制品要求低溫保存（-15℃以下），2～8℃僅存3～6 個月，因此非常不利于產品的使用和保存［3］。為了克服豬瘟活疫苗常規凍干保護劑存在的不耐熱、貯藏溫度低、保存期短等缺點，現市場較多企業推出豬瘟活疫苗（脾淋源）耐熱凍干保護劑，這大大提高了對冷凍干燥技術的要求。我們也多次進行了相同耐熱保護劑不同凍干曲線6次試驗，分別標記為S1組、S2組、S3組、S4組、S5組、S6組，不斷對凍干曲線進行改進和優化，從中篩選出了1 條適合當前耐熱保護劑的最佳凍干曲線。

1　材料與方法

1.1設備性能與材料

1.1.1凍干機性能。東富龍Lyo-1型1m2 凍干機，各項指標達到出廠時要求即可。

1.1.2凍干材料。豬瘟兔化弱毒株從中國獸醫藥品監察所購買，用家兔繼代，脾淋組織毒對家兔的最小感染量為≤10-5/mL。選擇定型熱和輕型熱反應兔，從體溫下降及其以后的24 h內剖殺，以無菌手術采取脾臟和腸系膜淋巴結，置于-15℃以下保存備用［4］。耐熱保護劑成分以2%明膠、5%蔗糖、2%聚乙烯吡咯烷酮為基礎，均有由美國Sigma公司生產。對照組采用常規5%蔗糖脫脂奶粉保護劑。

1.2方法

1.2.1要求。要求試驗產品和對照組產品均使用相同批次的組織毒，配苗比例完全一致。

1.2.1.1試驗組苗配制。在百級潔凈環境下，將采取的脾淋組織先研磨、再用80目銅紗網進行過濾，去除殘渣，與耐熱保護劑混合均勻后定量分裝，根據文獻［4］的要求，每頭份脾淋苗不少于組織毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.1.2對照組苗配制。按以上同樣方法將家兔脾淋組織毒進行研磨，然后用80目銅紗網進行過濾，再添加5%蔗糖脫脂奶粉保護劑，每頭份脾淋苗不少于組織毒0.01 g，每瓶2.0 mL，每批疫苗配制100瓶左右。

1.2.2凍干。將6組試驗連同對照組一起采用常溫入箱，預凍要求、降溫速率、升華溫度（表1），至板層溫度降至-45℃時控制在此溫度，待制品接近該溫度，開始計時并保持2 h，目的是使所有制品溫度降至共晶點以下，待制品接近升華溫度該溫度后，可判斷結束一期升華。

解析干燥使板層溫度控制在25℃保持5 h，或短暫關閉中隔閥觀察真空上升速率達到設計要求，方可判斷凍干結束，壓塞釋放真空，結束該批次凍干（圖1）。

1.2.3成品檢驗。凍干后成品按照文獻的要求［4］進行無菌檢驗、真空度測定、物理性狀、剩余水分以及效力檢驗。

1.2.4耐老化穩定性試驗。將檢驗合格的制品置于37℃作耐老化試驗，分別保存7天和10天，然后進行相關檢驗。

表1　6組試驗曲線表

圖1　凍干曲線圖

2　結果

2.1凍干后成品檢驗

6組試驗連同對照樣品在凍干結束后，分別取樣進行編號，按照文獻規定，選用同一批試驗用兔，對其進行檢驗，各項指標必須都要符合文獻的要求。

2.2無菌及真空度檢驗結果

表2 各批次無菌及真空度檢驗

2.337℃保存下的物理性狀及剩余水分測定結果

根據要求將凍后制品放置37℃，分別為7天、10天，后取樣進行物理性狀和水分含量檢測。其中S4組試驗、S5組試驗和S6組試驗產品均出現干縮情況，而且水分超標，不符合規程要求，其它樣品全部合格（表3）。

2.437℃保存不同時間效力測定結果

37℃放置7天、10天后進行效力檢測，除S4、S5、S6組試驗出現干縮情況未進行檢測外，其它各組耐熱保護劑的效力檢測均符合要求，但是5%蔗糖脫脂奶粉的對照均達不到要求（表4）。

表3 在37℃條件下疫苗物理性狀與水分含量變化

表4　37℃保存不同時間效力測定結果

3　討論

3.1預凍降溫速率

根據制品保護劑組分，結合產品的特點，在允許的條件下采取快速降溫的辦法，這樣可使冰晶快速形成，產生較大的冰核，有利于水分的快速蒸發。

3.2一期升化溫度

通過測到的共晶點使制品溫度低于10℃以下保溫2小時，在關鍵的一期升華階段，一定控制好板層溫度，不可使升華界面溫度超過共晶點溫度，否則就會出現制品塌陷，凍后會發現干縮情況。

綜上所述，我們認為耐熱保護劑在凍干過程中需要根據保護劑的不同組分，進行凍干曲線的合理調整。前期測量出制品的共晶點，在一期升華溫度相同的情況下，預凍降溫速率對制品凍型就顯得尤其重要。因為制品在預凍階段，冰晶形成的快慢，對升華時水分子逃逸的空間起著關鍵性的影響作用。不斷調整試驗，對凍干曲線進行改進和優化，最終篩選一條合適的凍干曲線，縮短了產品凍干時間，降低了生產能耗，而且有利于產品質量的穩定，對我們今后耐熱保護劑的冷凍干燥研究具有重大意義。

［1］ 姜平.獸醫生物制品學［M］.第二版.北京：中國農業出版社，2003：252.

［2］ 王玉琳，曾鳴，王玲，等. 病毒活疫苗凍干保護劑篩選研究［J］. 微生物學免疫學進展，1996，24（1）：22.

［3］ 王文成. 獸醫生物制品耐熱凍干保護劑的研究進展［J］.畜牧獸醫科技信息，2002（12）：7.

［4］ 中華人民共和國農業部. 中華人民共和國獸用生物制品規程2000年版［S］.北京：化學工業出版社，2000.

（責任編輯：胡藕祥）

Study on Freeze-drying Technology of Heat Protection Agent of Live Classical Swine Fever Vaccine

Wang Chunwei，Ye Shengdan
（Zhejiang Ebvac Biotech Co. Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310018）

With continuous application of swine fever live vaccine heat-resisting protective agents，the freeze-drying requirements are getting higher and higher. Through studies of the freeze drying processes，a suitable freeze-drying curve was selected： applying rapid and slow cooling in pre-freezing stage and selecting different temperatures during first sublimation stage，resulting in not only shortening the drying time，but reducing energy. The study provide the research direction of freeze-drying with heat-resisting protective agents in future.

freeze-drying；live classical swine fever vaccine；heat protection agent；freeze drying curve

S859.79+7

A

1005-944X（2015）11-0084-03