miRNA在骨科疾病中的研究進展

杜勇軍等

【關鍵詞】 微小RNA；骨肉瘤；骨性關節炎；骨質疏松癥；類風濕性關節炎

中圖分類號：R68 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.025

miRNA是近些年來研究的一大熱題。它是在進化上具有高保守性的非編碼蛋白序列，多在真核生物及病毒中被發現。其主要是通過與靶向信使RNA特異性結合，產生譯翻譯抑制和RNA降解。它參與生物體內多種調控途徑且與多種疾病的發生機制有著密切的聯系，如腫瘤的發生、感染性疾病、自身免疫性疾病及心腦血管疾病等。miRNA的發現對分子生物學領域的發展有重要意義，并對多種疾病的基因靶向治療提供了新的方向。本文以miRNA的生物學特性為基礎，結合其在骨科疾病中的發生、發展中的研究進展展開綜述。

1 miRNA的一般概述

1.1 miRNA的發現及合成

miRNA最早發現于1993年，Lee等人在秀麗絲蟲中發現了miRNA家族中的第一個成員Lin4，開始并未吸引人們的目光，直到2000年，Reinhart等[1]在絲蟲體內發現了另一個成員miRNAlet7，并提出其調控基因表達的作用可能是多種生物中所共存的機制這一學說。由此，miRNA的出現給學術界帶來了又一大研究課題，不斷有關于miRNA的發現、學說等浮現在人們眼前，最終科學家們在線蟲、果蠅、哺乳動物、病毒等中發現了大量的此類RNA，并統一命名為miRNA。miRNA的合成是一個比較復雜的過程，其中需要多種酶的參與[2]。首先是在細胞核內，編碼miRNA信息的基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄成具有特殊發夾結構的primiRNA；其次在Drosha酶的微切割下形成具有莖環結構的miRNA前體，稱為：premiRNA，長度60～70 nt，最終premiRNA轉移到胞漿后在Dicer酶的作用下形成一個5端磷酸化、3端有2個游離核苷酸的不完全互補且不穩定的雙鏈RNA分子，并迅速降解成為長度為21～25 nt的單鏈非編碼的miRNA；最后由最終產物與靶基因結合來發揮基因調控作用。

1.2 miRNA的作用機制及檢測技術

miRNA是在真核生物中發現的非編碼蛋白、短序列且高保守的小分子RNA。成熟的miRNA通過與靶向mRNA的3非翻譯區域結合來實現基因調控。根據其結合匹配程度不同可分為兩種作用機制。一類是與靶向RNA完全或者近似完全配對，而發揮與siRNA類似的作用，引起靶mRNA的降解，從而抑制其翻譯；另外一類是與靶向RNA不完全的互補配對時，miRNA主要通過抑制靶RNA翻譯時的啟動和延長階段達到抑制翻譯的作用。隨著人類發現miRNA的重要功能后，其檢測技術也有了突飛猛進的進步，如印跡技術、陣列雜交技術、反轉錄PCR（RTPCR）技術、電化學檢測技術等[3]。其中最早使用的是印跡雜交技術（即nothern blotting），后來Chen等[4]將RTPCR技術引入到miRNA檢測中，并可以實時定量，后續該技術逐漸發展成人們檢測miRNA的最常用技術。

2 miRNA與骨科疾病的相關性

2.1 miRNA在骨肉瘤中的表達

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是指成骨間葉細胞所產生的原發惡性骨或軟組織的惡性腫瘤，其發病率在原發性惡性腫瘤中占據首位，以成骨或骨樣組織的梭形基質細胞為特征。多發于青少年，且男性多于女性，主要好發于干骺端，其中以股骨下段及脛骨上段多見，且可發生肺部轉移，治療起來比較棘手。早期治療的預后較差，手術后5年存活率僅為5%～20%，而隨著新型輔助化療的出現，其5年存活率提升至60%～70%。但一旦腫瘤發生轉移治療起來相當困難，且預后非常不理想。故對OS的發病機制、治療方案等研究仍需不斷拓展。隨著miRNA的出現，不少學者通過實驗發現，miRNA在OS的發病及病情發展中有著密切的聯系，這為OS的臨床研究開辟了新的道路。

早在2009年就有文獻報道[5]miRNA1及miRNA206基因的表達可促進骨骼肌細胞分化并能抑制橫紋肌肉瘤的生長。而miRNA1可以抑制甲硫氨酸（MET）的表達，MET具有酪氨酸激酶活性，在多種癌癥中均有表達并與調節蛋白有關，并發現在骨肉瘤的腫瘤細胞中miRNA1有著差異表達。研究發現[6]，miRNA21在骨肉瘤中的表達明顯高于正常骨組織，其對骨肉瘤的診斷及判斷預后有著重要的作用，研究同時發現miRNA21的表達與RECK蛋白有一定的相關性。miRNA21可能主要通過調控RECK蛋白的表達來調節骨肉瘤的入侵和轉移。另有研究發現[7]，骨肉瘤病變組織中的miRNA34明顯低表達，其主要通過與CDK6、E2F3、E2、Bcl2等靶點結合，從而抑制P53介導的G1抑制和凋亡。P53是一種抑癌基因，編碼分子量為53 KDa的蛋白質，并由此得名，其可分為野生型和突變型，P53對細胞周期的調控主要通過下游基因WAF1實現，突變型P53不能激活其下游基因而產生P21WAF1，導致細胞周期停止在G1期，促進細胞異常增殖，從而導致腫瘤發生發展，而野生型P53的作用正好與突變型相反。Lulla等[8]在骨肉瘤細胞中通過RTPCR發現了22種與正常骨組織細胞相比異常表達的miRNA，其中高表達的有四種：miRNA135b、miRNA150、miRNA5425p和miRNA652，而miRNA135b、miRNA150早已被證實與腫瘤的發生有關。Won等[9]在骨肉瘤的標本中發現有10種miRNA的表達明顯高于正常人，其中發現notch信號通道中的miRNA199b5p與OS的發病密切相關，并表示miRNA199b5p抑制劑可能會用于骨肉瘤的治療。隨著科技的進步，越來越多與OS相關的miRNA逐漸浮出水面，這無疑為其治療提供了新的研究方向。

2.2 miRNA在骨性關節炎中的表達endprint

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是關節外科較常見的老年性疾病，主要以關節軟骨的平衡遭受破壞所致的慢性、漸進性的退行性關節病變為主，故又稱退行性關節炎。OA的發病機制非常復雜，至今發現的主要發病因素有：遺傳、年齡、體重、外傷、關節炎癥、細胞因子等。諸多發病因素中，歸根結底還是關節軟骨的異常發育。而有報道顯示miRNA在關節軟骨細胞的發育與修復過程中有一定的表達規律，這無疑給骨性關節炎的研究者提供了另一廣闊的探索空間。Miyaki等[10]通過基因敲除的方法建立miRNA140基因缺失的小鼠模型，誘導出了小鼠關節軟骨呈現原發性骨性關節炎的改變，相反利用轉基因技術使小鼠表達miRNA140，發現這些小鼠有抵抗抗原誘導性關節炎的能力。同時他們也發現了miRNA140基因敲除的小鼠軟骨內成骨障礙，從而導致小鼠四肢短小及骨骼畸形等改變。有研究發現miRNA146α和miRNA22的表達與基質金屬蛋白酶13的表達有一定聯系，但具體表達水平尚不清楚，可見它們的表達與骨性關節炎的發生、發展也密不可分。隨著研究的深入，miRNA140在骨性關節炎中的基因調控作用也逐步得到闡述。后續的研究[11]還發現，miRNA140基因的表達與聚蛋白多糖酶5（ADAMTS5）及金屬基質蛋白酶13（MMP13）的表達水平有著直接的聯系，且miRNA140基因表達減少時ADAMTS5及MMP13基因表達明顯增高。而其他的研究也表明[12]，ADAMTS5及MMP13在OA患者的關節軟骨細胞中的高表達是導致關節軟骨基質降解的兩種重要的水解酶。可見miRNA140基因的表達高低直接影響著軟骨的生長與破壞水平。而另有研究發現[13]，在miRNA140基因敲除的小鼠實驗中證實了miRNA140可抑制BMP信號通路，從而保持軟骨細胞分化，這一現象與Dnpep的過度有關，而miRNA140基因缺失的小鼠Dnpep高表達導致BMP信號降低而使關節軟骨被破壞。

2.3 miRNA在類風濕關節炎中的表達

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，多為慢性起病，主要特征是關節滑膜的炎癥。RA以侵犯多關節為主，呈多發性和對稱性。主要病理特征是關節滑膜增厚合并大量炎癥細胞浸潤，血管翳形成及軟骨組織的侵蝕與破壞[14]。隨著RA的發展最終將導致關節強直畸形、功能障礙，甚至殘廢。RA屬于一種自身免疫性疾病，影響其發生、發展和轉歸的因素較多。而近年大量研究發現miRNA基因的表達與多種自身免疫性疾病有關，并且可能參與調控RA的發病及疾病發展。研究發現[15]，miRNA146a在RA患者中的外周血單核細胞中表達明顯高于正常人，且與RA患者疾病活動性相關的血沉、C反應蛋白、TNFα表達呈正相關，顯然miRNA146a的表達水平與RA的發病有著直接聯系。Stanczyk等[16]研究發現，miRNA203基因在RA患者中有促進炎癥的發生和關節破壞的作用，主要是它在滑膜組織中的高表達引起MMP及IL6的產生增多，而MMP及IL6在RA的診斷中有著重要價值。Niederer等[17]研究發現，miRNA34的表達水平與RA患者滑膜成纖維樣細胞的凋亡有著密切的聯系，并通過實驗證明miRNA34的表達水平上調可抑制滑膜成纖維樣細胞的凋亡。而miRNA34主要是通過自身的高表達引起其靶蛋白X連鎖凋亡抑制蛋白（Xlinked inhibito of apoptosis protein，XIAP） 的表達上調，并且XIAP的表達抑制RA患者滑膜成纖維樣細胞的凋亡。荀春華等[18]通過定量PCR檢測技術檢測血漿及外周單個核細胞（PBMC）中四種miRNA（miR146a、miR223、miR16、miR155）的表達情況，結果發現在RA患者的PBMC中，四種miRNA的表達均上調。同時，還有研究發現[19]miR155高表達可抑制MMP1及MMP3的產生，從而對抗RA患者關節的破壞。

2.4 miRNA與骨質疏松癥的相關性

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是多因素共同作用下導致成骨與破骨的平衡被打破后引起的以骨量減少，骨組織微細結構退化、破壞為主要特征的全身性代謝性骨髂疾病。在2009年國際骨質疏松癥基金會上首次報告了亞洲人群的骨骼健康狀況，并指出在中國骨質疏松的患者將逐年增長。OP多發于老年人，其導致骨骼的強度降低且脆性增高，從而導致骨折的高發，而骨折常常成為老年人致命的打擊。目前人們對OP的認識仍有限，因而OP的發病機制、預防、治療等方面的研究仍待深入。影響OP發生、發展的因素很多，如遺傳因素、內分泌系統因素、營養狀況、運動負荷等等。而近年來，人們的目光逐漸轉移到微觀環境中來，研究發現OP與miRNA在骨組織中的表達有一定的聯系。多個miRNA參與了成骨細胞的分化成熟過程，如miRNA503、miRNA3960通過對破骨細胞和成骨細胞分化的相關基因表達的調控，在骨質疏松的發生過程中有著密切的聯系[20]。而早在2008年LI等人[21]在BMP2誘導骨髓干細胞向成骨細胞分化過程中發現了有多種miRNA的參與，其中25個miRNA中有22個表達下調，且具體作用機制當時仍不清楚。Mizuno等[22]實驗發現miRNA210在BMP4誘導骨髓基質細胞ST2 成骨分化過程中表達明顯上調。后來另有研究發現[23]miRNA1423p基因的表達可抑制APC 基因的蛋白表達并且激活Wnt通路，從而增強hFOB1.19細胞向成骨細胞分化，可見miRNA1423p基因的表達量與成骨分化呈正相關。另外還發現miRNA29b、miRNA26a、miRNA30a5p、miRNA2861、miRNA20b等均有促進細胞成骨分化的作用。與此同時，也有研究發現許多miRNA在成骨過程中起著負調控的作用。老年女性絕經后OP患者的骨骼標本中的miRNA表達水平發生了明顯的變化，miRNA214水平明顯增高，且其表達與成骨呈負相關。研究發現[24]小鼠原代成骨細胞在體外礦化過程中發現了miRNA93的表達明顯降低，且負調控成骨細胞體外礦化能力。Eskildsen等[25]研究發現miRNA138可抑制成骨，其主要是通過抑制FAKERK1/2信號通道，導致下游的Runx2和OSX的磷酸化作用降低，從而抑制成骨骨分化。endprint

3 小結

miRNA在人的體液、骨骼、肌肉等多種組織、器官中持續且穩定的存在，研究發現miRNA與多種疾病的發生、發展及治療有著密切的關系，可作為多種疾病輔助診斷和判斷預后的新標記物。而miRNA在骨科疾病中的過高或過低的表達，為我們提供了新的思路，雖然目前在骨肉瘤的研究中發現了許多重要的miRNA，但要在骨肉瘤的診斷、治療上起到歷史性變革作用的發現仍需繼續深入研究。而在骨質疏松癥的問題上，miRNA也表現頗為突出，研究發現了促進成骨細胞成骨分化的miRNA，這必將成為后期抗骨質疏松治療的一個新的靶點。但至今仍沒有很好的方法去早期診斷和排除骨質疏松癥，所以還需要很多努力。同時miRNA在關節疾病中的重要作用也逐步得到闡釋，它與OA患者的關節軟骨平衡有著密切的聯系，所以若能通過miRNA基因的調控解決軟骨細胞的修復、再生等問題，這將為骨性關節炎、類風濕關節炎等患者送去佳音。筆者相信，通過人類的共同努力，在不久的未來，這些難題都將被一一攻克。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2015-08-18 修回日期：2015-10-22）

（編輯：潘明志）endprint