大鼠激素性股骨頭壞死的2種造模方法比較*

趙振廣，潘樹義，李航

（1.中國人民解放軍醫學院，北京100853；2.中國人民解放軍海軍總醫院高壓氧醫學中心，北京100048）

大鼠激素性股骨頭壞死的2種造模方法比較*

趙振廣1，2，潘樹義1，2，李航2

（1.中國人民解放軍醫學院，北京100853；2.中國人民解放軍海軍總醫院高壓氧醫學中心，北京100048）

目的比較不同地塞米松用藥方案腹腔注射建立大鼠激素性股骨頭壞死模型的可靠性及成功率，為大鼠激素性股骨頭壞死模型的建立方法提供基本數據。方法將30只雄性Wistar大鼠隨機分為A組、B組、C組，各10只。A組給予地塞米松磷酸鈉注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B組給予地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C組給予0.9%氯化鈉注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持續8周。于首次給藥8周末攝雙髖正位X線檢查，次日處死取雙側股骨頭標本，行組織形態學檢查。結果A、B、C 3組大鼠股骨頭雙髖正位X線檢查均未發現異常，但在病理切片上可發現顯著性差異，證實激素性股骨頭壞死造模成功，而B組股骨頭壞死改變較A組明顯嚴重。結論腹腔注射地塞米松20 mg/（kg·d），1次/周，持續8周的方案和地塞米松10 mL/（kg·d），2次/周，持續8周的方案均能成功建立大鼠激素性股骨頭壞死的早期模型，但后一種造模方案更優。

股骨頭壞死；激素；地塞米松；大鼠；動物試驗

隨著糖皮質激素在臨床工作中的大量應用，目前激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）已成為非創傷型股骨頭壞死的首要病因［1-2］，該病進展迅速，如不能采取有效干預手段，將很快進入不可逆的病理進程，且缺乏有效根治方法［3］。有關激素引起股骨頭壞死的學說很多，然而其確切機制和始動環節仍未明了，因此，建立理想的股骨頭壞死的動物模型，是研究SANFH發病機制和早期診治的重要手段。本研究中擬采用長期地塞米松小劑量腹腔注射的方法，比較不同地塞米松用藥方案的造模效果，為大鼠早期SANFH模型的成功建立提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

健康雄性4月齡Wistar大鼠（軍事醫學科學院提供，合格證編號：SCXK-＜軍＞2012-004）30只，體重（0.21±0.01）kg，將大鼠分6籠，每籠5只，飼養于海軍總醫院實驗動物中心，自由飲水進食，飼養條件一致，所喂養的顆粒飼料由海軍總醫院實驗動物中心提供。地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團容生制藥有限公司，國藥準字H41020036）；水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673）；多聚甲醛及10%EDTA脫鈣液（自配）。AXIOM Aristos MX型西門子X線攝影成像系統（海軍總醫院影像科提供）；動物固定架（自制）；RM2235石蠟切片機、LEICA DM500三目生物顯微鏡及圖像信號采集與分析系統（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及分組

所有大鼠適應性喂養1周后，電子稱稱重并編號，采取隨機數字表法將35只大鼠分為3組，各10只。A組給予地塞米松磷酸鈉注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B組給予地塞米松磷酸鈉注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C組為空白對照組，給予0.9%氯化鈉注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持續8周。

1.2.2 大體觀察X線檢查

主要觀察試驗動物體重變化、步態、毛發光澤度及動物股骨頭大體形態。于距首次注射8周末，全部動物水合氯醛麻醉，攝雙髖正位X線片。

1.2.3 病理組織學檢查

X線檢查后1 d，采用放血處死法，固定動物，取雙側股骨頭，將所取標本按動物編號分別置多聚甲醛溶液中固定2 d，然后置10%EDTA緩沖液中脫鈣，每周更換脫鈣液1次，持續2個月后通過探針檢測判斷脫鈣完全。將脫鈣后的股骨頭常規脫水、透明、包埋制成蠟塊，沿縱面剖開，切片行HE染色。光學顯微鏡下觀察骨髓組織、骨小梁、成骨細胞及骨細胞的形態數量變化，并計算空骨陷窩率。

1.3 統計學處理

應用CHISS 7.0統計軟件分析，計量數據用均數±標準差表示，以P＜0.05為檢驗水準，進行單因素方差分析，進一步分析采用SNK-q檢驗法，如數據不符合正態分布或組間方差不齊，則采用秩和檢驗分析。

2 結果

2.1 大體觀察

3組動物均無意外死亡，未見明顯步態異常。A組及B組可見毛發雜亂，缺少光澤并伴有明顯消瘦，且B組消瘦更明顯（表1），C組大鼠體型正常。3組動物股骨頭外觀均晶瑩光滑，肉眼觀察無明顯差異。

2.2 X線檢查結果

3組動物行髖關節正位X線檢查，結果均無異常，見圖1。

2.3 病理組織學觀察

選取股骨頭軟骨下區域作為主要觀察視野。C組標本骨小梁排列規整，連續性好，骨髓組織含量豐富，正常形態骨細胞及成骨細胞在視野中多見，骨細胞空陷窩罕見；B組標本均出現骨小梁稀疏、變細，甚至斷裂或被疏松結締組織包繞分解成云片狀，結構紊亂，骨髓組織壞死多見，視野中成骨細胞稀少，骨細胞核固縮、邊聚甚至消失形成空骨陷窩；A組標本亦出現輕微股骨頭壞死征象，骨髓組織有壞死，但總體含量較B組豐富，骨小梁亦有稀疏、變細現象，但明顯輕于B組，可見成骨細胞，空骨陷窩少見。見圖2。在高倍鏡下任意選取10個視野，計數形態完全正常的骨細胞數量和空骨陷窩細胞數量，并計算空骨陷窩率，以判斷股骨頭壞死程度，結果見表2。可見，3組間正常形態骨細胞數量及空骨陷窩率兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 3組大鼠喂養8周后體重大小比較

圖1 大鼠雙髖正位X線片

圖2 病理組織學觀察（HE×100）

表2 3組股骨頭切片正常形態骨細胞數量對比（±s）

表2 3組股骨頭切片正常形態骨細胞數量對比（±s）

組別A組B組C組切片數（張）20 20 20正常形態骨細胞數量（個）17.5±2.24*▲11.7±2.30*31.0±5.15空骨陷窩率（%）12.0±2.16*▲16.5±2.53*7.3±1.25

3 討論

關于如何獲得一個經濟可靠的SANFH動物模型，學術界進行的研究很多，然而想得到3期以上的激素性股骨頭壞死模型卻十分困難，分析主要有以下2個原因：其一，動物對激素的耐受性與人類不同，如白兔對激素耐受性差，大鼠則相反，注射劑量小易導致造模失敗，而劑量大又會引起試驗動物大量死亡；其二，四足動物與人類股骨頭解剖上區別明顯，激素之所以在人類容易引起股骨頭壞死不僅是因為局部血管解剖因素，作為負重關節，機械應力的原因亦不可忽視，而在四足動物，股骨頭處的負重顯然要小得多，此類模型一般僅出現股骨頭壞死的早期表現，且壞死區域在股骨頭少見，反而干骺端更多見［4］。理論上，早期SANFH的動物模型更易獲得，但實際造模成功率并不高。

Kuribayashi等［5］嘗試用肌肉注射甲基強的松龍的方式建立兔SANFH模型，注射劑量為20 mg/（kg·d）。結果顯示，1個月后股骨頭壞死的發生率為70%，但有20%的試驗動物在肌肉注射甲基強的松龍后死亡；Takao等［6］使用同樣的劑量造模，卻以失敗告終，僅觀察到股骨近端干骺端的骨髓壞死；Zhang等［7］則采用皮下注射的方式給予家兔甲基強的松龍，劑量為21 mg/（kg·d），1個月后，有80%的家兔可觀察到股骨頭壞死發生。Yang等［8］在建立鼠SANFH模型中使用了2種不同方案，給藥方式為在飲水中加入地塞米松，2種方案均在第1周加入地塞米松4 mg/（L·d）。持續給藥組從第2周起給藥劑量改為2 mg/（L·d），間斷給藥組則僅在每周中的后3.5 d給予4 mg/（L·d），2種方法總給藥量相同，持續12周后的觀察結果提示，持續給藥組骨壞死的發生率為45%，顯著高于間斷給藥組的8%。Kerachian等［9］將潑尼松緩釋微丸植入大鼠皮下，平均釋放劑量相當于1.82～2.56 mg/（kg·d），為期90 d，成功觀察到骨細胞的凋亡。

根據以上研究可推測，在總激素量不變的情況下，增加給藥頻率，激素所產生的不良反應更明顯，因而股骨頭壞死發生率及壞死程度更重，符合臨床上所行“激素間斷性給藥”方案研究結果［10］。本研究中采取了2種給藥模式進行造模來驗證這一推測，參考前文提及的Yang等［8］試驗中的總給藥劑量，本研究中同樣采用地塞米松進行造模，給藥方式為腹腔注射，A組和B組總注射劑量相同。參考大量學者的試驗研究，選定8周作為時間節點來判定造模效果。結果顯示，A、B兩組大鼠均有明顯消瘦，且B組大鼠體重減輕更明顯，推測更高的給藥頻率產生的不良反應更強。病理切片結果提示，雖然A、B兩組大鼠均有骨髓壞死，正常形態骨細胞數量減少等早期骨壞死改變，但B組在股骨頭組織病理切片上損害更嚴重，骨髓壞死的面積也有更大趨勢。

一般認為，骨壞死的病理改變主要為骨髓組織壞死并伴有骨小梁中空骨陷窩增多，可見彌散性的骨細胞核固縮［11］，本試驗中A、B兩組的病理結果均與之相符。根據目前應用最廣泛的激素性股骨頭缺血性壞死國際骨循環研究學會1991分期，其中0期的表現為，X線片、核磁共振、骨掃描檢查均無異常，但在行病理學檢查時可發現股骨頭內組織壞死；Ⅰ期表現為，X線片正常，但核磁共振和骨掃描可發現異常，此期股骨頭形態無異常，病理切片上可觀察到壞死灶與正常活骨界限明顯。本試驗中未行核磁共振及骨掃描檢查，但根據X線檢查及病理切片結果認為，A、B兩組大鼠均符合0期SANFH的改變，且B組造模方案空骨陷窩率更高，骨細胞壞死更明顯，較A組更優。此外，二者在病理上的結果均提示早期SANFH中已存在骨細胞死亡，成骨細胞減少的現象。成骨細胞是參與骨修復的最主要細胞，已有研究表明，激素對成骨細胞有明顯的抑制作用。Smith等［12］曾報道激素可調節細胞周期來影響成骨細胞增殖，還有研究發現激素可促進成骨細胞凋亡［13］，可推測激素在破壞股骨頭骨細胞的同時還通過抑制成骨細胞減慢其修復反應，使得激素性股骨頭壞死中的修復反應非常微弱。因此，打破壞死、修復之間的平衡可能是激素導致早期骨壞死發生的機制之一，也正是由于修復速度趕不上破壞速度，使得骨壞死不斷進展，最終發展到晚期的股骨頭塌陷。

本研究的不足之處在于，所得到的動物模型僅有早期骨壞死改變，造模方案操作簡單，用時較短，動物均無死亡，且組內大鼠在病理切片的表現上呈均一性反應，其中B組方案的動物模型骨壞死改變更明顯，將該動物模型應用于試驗研究中效果更佳，可對深入研究SANFH的發病機制及早期干預措施起到積極的推動作用，值得在科研中推廣運用。

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Comparison of 2 Rat Modelling Methods of Glucocorticoid-Induced Avascular Necrosis

Zhao Zhenguang1,2,Pan Shuyi1,2,Li Hang2
（1.Medical School of PLA,Beijing,China100853；2.Department of Hyperbaric Oxygen,The Navy General Hospital of PLA, Beijing,China100048）

ObjectiveTo compare the reliability and success rate of the different intraperitoneal injection of dexamethasone regimen in glucocorticoid-induced avascular necrosis in rats model，and provide the basic data for setting up rat models of steroid-induced avascular necrosis of femoral head.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into group A（10）and group B（10），group C（10）.Group A was given dexamethasone sodium phosphate injection 20 mg/（kg·d），1 time/week for 8 weeks；group B was given dexamethasone sodium phosphate injection 10 mL/（kg·d），2 times/week for 8 weeks；group C was given 0.9%chloride 20 mL/（kg·d），1 time/week for 8 weeks.ResultsNo abnormalities were found in double hip X-ray examination of the three groups，but significant differences can be found on pathological section，the differences confirmed that building hormone osteonecrosis is successful and the degree of femoral head necrosis of Group B is more serious than group A.ConclusionBoth methods（intraperitoneal injection of dexamethasone，20 mg/（kg·d），1 time/week，for 8 weeks andintraperitoneal injection of dexamethasone，10 mL/（kg·d），2 times/ week，for 8 weeks）can successfully established early stage rat models of glucocorticoid-induced avascular，and the latter method is better than the previous one.

femoral head necrosis；glucocorticoid；dexamethasone；rat；animal experiment

R965；R332

A

1006-4931（2015）20-0016-03

趙振廣，碩士研究生，主治醫師，研究方向為高壓氧醫學；潘樹義，博士研究生，主任醫師，研究方向為高壓氧醫學，本文通訊作者，（電子信箱）psy9992011@163.com。

2015-03-30）

*北京市自然科學基金資助項目，項目編號：7154241；全軍醫學科技青年培育項目，項目編號：13qnp075。