固定化核苷磷酸化酶的制備及其性質研究

黃炯威，劉寧，勞偉明，周華潤，劉桂禎

（1.開平牽牛生化制藥有限公司，廣東江門529339；2.廈門大學生命科學院，福建廈門361000）

固定化核苷磷酸化酶的制備及其性質研究

黃炯威1，劉寧2，勞偉明1，周華潤1，劉桂禎1

（1.開平牽牛生化制藥有限公司，廣東江門529339；2.廈門大學生命科學院，福建廈門361000）

目的優化核苷磷酸化酶的固定化工藝，并對固定化酶的性質進行研究。方法通過正交試驗優化核苷磷酸化酶（包括嘌呤和嘧啶核苷磷酸化酶）固定化條件，并進一步對固定化核苷磷酸化酶的最適pH、溫度及其穩定性進行研究。結果固定化酶條件為pH=8.0，溫度為25℃，蛋白載量為20 mg/g載體，固定化時間為6 h；固定化核苷磷酸化酶的最適pH=7.5，最適溫度為40℃，固酶連續使用20批次酶活力無明顯損失。結論固定化核苷磷酸化酶穩定可靠，適合應用于工業化生產。

核苷磷酸化酶；固定化；制備

核苷磷酸化酶可分為嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase，EC2，4，2，1）和嘧啶核苷磷酸化酶（PyNPase，EC2，4，2，2）［1-2］。此酶能可逆地催化核苷（或脫氧核苷）磷酸化反應，其反應式為［3］：Rib（或dRib）-堿基1+Pi→Rib（或dRib）-1-磷酸+堿基1，Rib（或dRib）-1-磷酸+堿基2→Rib（或dRib）-堿基2+Pi。利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷（Ara2A），2′-脫氧腺苷（2′-Deoxyade-2-nosine，dAR）、三氮唑核苷（Ribavirin）、5-氟尿苷（5-FUR）等［4-5］。在工業生產應用中，與游離酶相比，固定化酶具有穩定性高、酶可反復使用、產物純度高、產物分離簡單等優點，本研究中對嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的固定化條件進行了充分研究，并進一步研究了固定化核苷磷酸化酶（簡稱固定化酶）的最適pH、溫度及穩定性。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

嘌呤核苷磷酸化酶液酶和嘧啶核苷磷酸化酶液酶［2］為開平牽牛生化制藥有限公司自制；固酶載體GZ011為本公司實驗室自選共價結合型載體；腺苷、胞苷及其他檢測用試劑均為國產分析純試劑。LC-15C型高效液相色譜儀（島津儀器＜蘇州＞有限公司）；TU-1901型分光光度計（北京普析通用儀器公司）；VE-180型電泳槽（上海天能公司）；Eumix-R30型攪拌機（上海弗魯克公司）。

1.2 方法［5］

酶活力定義及測定：以腺苷和胞苷為底物，分別加入一定量的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶催化反應，準確計時，用高效液相色譜儀監測腺嘌呤和胞嘧啶的生成量，計算酶活力，其定義為每分鐘單位酶量催化生成的腺嘌呤或胞嘧啶的微摩爾量。

蛋白檢測：以牛血清白蛋白（BSA）配制標準蛋白溶液，按考馬斯亮藍法（Bradford法）制作標準曲線及檢測樣品蛋白含量。

酶固定化：嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶經提取純化后，加入適當pH的緩沖液稀釋，以及一定量的GZ011載體，在適當溫度下攪拌固定化，固定化完成后過濾分離固定化酶與殘酶液，固定化酶用pH緩沖液洗滌數次，取固定化酶樣品進行酶活檢測。

固定化酶性質研究：以腺苷和胞苷為底物，分別加入一定量的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶催化反應，改變反應液pH和溫度，用高效液相色譜儀監測腺嘌呤和胞嘧啶的生成量，計算底物轉化率，根據不同反應條件下的轉化率找出固定化酶的最適pH和最適溫度。取固酶樣品連續投料反應多個批次，監測不同反應批次后的固酶的酶活力損失情況，分析固定化酶的穩定性。

2 結果

2.1 固定化方法優化

采用L9（34）正交試驗方案，其中固定化溫度選擇15，20，30℃3個水平，固定化酶載體的蛋白載量為15，20，30 mg/g 3個水平，固定化pH條件選擇了7.0，8.0，9.0 3個水平，固定化時間為4，6，8 h 3個水平，通過正交試驗以較少的試驗次數來優化固定化酶的條件，結果見表1?？梢?，4個考察因素中固定化pH對固定化酶酶活力影響最大，其次是蛋白載量，影響最小的是固定化時間，考慮到固定化溫度越高，對固定化前液酶的穩定性越不利，最終確定了固定化酶的最佳條件，即固定化溫度為25℃，固定化載體蛋白載量為20 mg/g，固定化pH=8.0，固定化時間為6 h。

2.2 固定化酶的最適pH

以催化合成阿糖腺苷試驗研究固定化酶的性質，在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤和50 mmol/L磷酸鹽、不同pH的反應液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，35℃條件下攪拌反應8 h，反應完成后用高效液相色譜儀測定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷量，計算反應轉化率。結果見圖1?？梢?，在反應液pH為6.0～9.0范圍內，pH為7.5時底物轉化率最高。

表1 固定化嘌呤核苷磷酸化酶及固定化嘧啶核苷磷酸化酶正交試驗結果

圖1 不同反應pH的轉化率

2.3 固定化酶的最適溫度

在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤、50 mmol/L磷酸鹽和pH=7.5的反應液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，在不同溫度條件下攪拌反應8 h，反應完成后用高效液相色譜儀測定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷量，計算反應轉化率。結果見圖2。可見，在試驗溫度范圍內，溫度越高，底物轉化率越高，溫度升到35℃以上后，轉化率升高幅度變小?？紤]到過高的反應溫度可能會影響固定化酶的使用壽命，固定化酶的最佳使用溫度暫定為40℃。

圖2 不同反應溫度的轉化率

2.4 固定化酶的穩定性

在含20 mmol/L阿糖尿苷、10 mmol/L腺嘌呤、50 mmol/L磷酸鹽和pH=7.5的反應液中，加入一定量的固定化嘌呤核苷磷酸化酶和固定化嘧啶核苷磷酸化酶，在40℃條件下攪拌反應8 h，反應完成后用高效液相色譜儀測定底物阿糖尿苷和生成的阿糖腺苷的量，計算反應轉化率。結果見圖3?？梢姡潭ɑ傅姆€定性非常好，在連續使用20批次后酶活力依然無明顯失活現象。

圖3 連續多批反應轉化率

3 討論

利用核苷磷酸化酶合成核苷類藥物應用前景非常好，而固定化酶催化技術在工業生產應用方面具有很大優勢。本研究中采用了L9（34）正交試驗方案對核苷磷酸化酶的固定化過程中的溫度、蛋白載量、pH和固定化時間等條件進行了研究，結果顯示，pH條件和固定化載體的蛋白載量對固定化酶的質量影響最明顯，最佳固定化條件為：溫度25℃，載體蛋白載量20 mg/g，pH=8.0，固定化時間6 h。結果顯示，固定化酶蛋白載量并非越大越好，過大的蛋白載量不僅浪費液酶原料，還可能限制酶的活性中心與底物的結合。另外，在對固定化酶的性質和穩定性研究中發現，在pH為7.5～8.0、反應溫度為40～50℃的條件下，固定化酶催化反應效果較理想，而在pH=7.5及40℃的反應條件下連續反應20批次后，各批次反應轉化率波動不大，固定化酶未見失活現象。在以上研究條件下，固定化核苷磷酸化酶的性能和穩定性皆有良好表現，可達到產業化生產應用的要求。

［1］魏元剛，倪孟祥，葛亞文，等.來源于產氣腸桿菌的嘧啶核苷磷酸化酶基因在大腸桿菌BL21中的表達［J］.藥物生物技術，2007，14（2）：94-98.

［2］黃炯威，莫世藝，劉寧，等.基因工程菌發酵表達核苷磷酸化酶條件的優化［J］.中國藥業，2014，23（7）：22-23.

［3］閆蓬勃，邱蔚然，丁慶豹.核苷磷酸化酶的產酶條件優化的研究［J］.藥物生物技術，2001，8（2）：83-85.

［4］樊華偉，傅紹軍，邵志宇，等.核苷類藥物酶法合成研究進展［J］.生物技術通訊，2005，16（11）：690-692.

［5］周長林，邱蔚然，周利，等.用大腸桿菌游離細胞酶法合成核苷藥物［J］.華東理工大學學報，1997，23（5）：535-539.

Preparation of Immobilized Nucleoside Phosphorylase and Research on Its Property

Huang Jiongwei1，Liu Ning2，Lao Weiming1，Zhou Huarun1，Liu Guizhen1
（1.Kaiping Genuine Biochemical Pharmaceutical Co.，Ltd，Jiangmen，Guangdong，China529339；2.Life Science Department，Xiamen University，Xiamen，FuJian，China361000）

ObjectiveTo optimize the immobilization process of the nucleoside phosphorylase and research on its property.Methods The immobilization process of the nucleoside phosphorylase（including purine and pyrimidine nucleoside phosphorylase）was optimized by orthogonal test，and took further study of the finest pH，temperature and stability of immobilized nucleoside phosphorylase.ResultsThe finest condition of immobilized enzyme was pH=8.0，25℃，20 mg/g protein loads and immobilize for 6 h；the finest condition for the immobilized nucleoside phosphorylase to catalyze was pH=7.5 and 40℃.There was no significant loss of activity of the enzyme after use for catalyzing 20 batches consecutively.ConclusionThe immobilized nucleoside phosphorylase is stable and reliable，which is suitable to application in industrial production

nucleoside phosphorylase；immobilized；preparation

IQ460.6；R977.6

A

1006-4931（2015）20-0032-03

黃炯威（1978-），男，工程師，研究方向為生化藥物，（電話）0750-2882338（電子信箱）jmlgz@126.com。

2014-07-11；

2015-03-04）