高效液相色譜法測定益母草堿大鼠血漿濃度及其藥代動力學研究

袁承軍，袁浩宇，俞瑜，王鵬

（1.四川省綿陽市中心醫院，四川綿陽621000；2.核工業四一六醫院藥劑科，四川成都610051）

高效液相色譜法測定益母草堿大鼠血漿濃度及其藥代動力學研究

袁承軍1，袁浩宇2，俞瑜2，王鵬2

（1.四川省綿陽市中心醫院，四川綿陽621000；2.核工業四一六醫院藥劑科，四川成都610051）

目的建立測定大鼠血漿中益母草堿質量濃度的高效液相色譜（HPLC）法，并研究益母草堿在大鼠體內的藥代動力學特征。方法8只SD大鼠尾靜脈注射益母草堿后，采用HPLC法測定血漿中益母草堿的質量濃度，流動相為乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調pH=4.0）=60∶40，波長為277 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃。結果益母草堿在大鼠體內分布符合二室模型，主要藥代動力學參數消除半衰期（t1/2α）為（0.46±0.13）h，t1/2β為（2.90±1.41）h，中心室分布容積（V）為（0.46±0.07）L/kg，藥時曲線下面積（AUC0-t）為（70.65±12.39）mg/（h·L）。結論該方法簡便、快速，可用于體內益母草堿的測定及藥代動力學研究。

益母草堿；高效液相色譜法；藥代動力學

益母草堿有多種生物活性，如改善心肌缺血、增加冠脈血流量、抗凝、抗血栓形成、保護中樞神經系統、調節血脂、縮宮止血、活血化瘀、抗糖尿病等作用［1-5］。筆者采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）法測定大鼠血漿中益母草堿的含量，并對益母草堿的藥代動力學特征進行了研究，現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

日本島津LC-2010C型高效液相色譜儀；島津LC-Solution型色譜工作站；德國賽多利斯BS224S型萬分之一電子天平；Avati30型高速離心機（Beckman公司）；XW-80型旋渦混合器（上海醫科大學實驗儀器廠）。鹽酸益母草堿（武漢東康源科技有限公司，批號為20120501）；鹽酸益母草堿對照品（成都貝斯特試劑有限公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。SD大鼠8只，體重180～200 g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司，合格證號為SCXK（滬）2008-0016；試驗前圈養3 d。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，3 μm）；檢測波長：277 nm；流動相：乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調pH=4.0）=（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 血樣處理

取血漿樣品0.1 mL，加入6%高氯酸溶液0.2 mL，旋渦沉淀蛋白1 min，10 000 r/min的速率離心5 min，取上清液進樣50 μL，記錄色譜圖和峰面積，以外標法按標準曲線計算血漿中益母草堿的質量濃度。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：大鼠空白血漿、大鼠空白血漿+益母草堿對照品、大鼠尾靜脈注射益母草堿后的血漿樣品色譜圖見圖1。益母草堿的保留時間約為7.5 min，血漿內源性物質及其他雜質與主峰的分離度符合要求，不干擾樣品的分離測定。

線性關系考察：取不同質量濃度的益母草堿對照品溶液20μL，加入0.1 mL空白大鼠血漿中，使血漿中含益母草堿系列質量濃度分別為0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/mL，照2.2項下方法操作，記錄色譜圖。以益母草堿的質量濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線方程A=3 526.1 C-1 093.3，r=0.999 4（n=7）。結果表明，益母草堿質量濃度在0.5～40.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，最低定量限為0.5 μg/mL。

圖1 益母草堿的高效液相色譜圖

精密度試驗：取0.1 mL空白大鼠血漿，配制高、中、低3種不同質量濃度的質控樣品各5份，照2.2項下方法分別在同1日內測定和連續測定3 d。結果質量濃度分別為1.0，5.0，20.0 μg/mL時，日內精密度RSD分別為4.97%，6.13%，5.52%（n=5），日間精密度RSD分別為7.85%，3.71%，4.69%（n=5），表明日內和日間精密度均良好。

提取回收率試驗：取空白血漿0.1 mL，分別配制成高、中、低質量濃度（1.0，5.0，20.0 μg/mL）的益母草堿血漿樣品（Cr）各1份，按2.2項下方法記錄峰面積，并求出各質量濃度下3次進樣峰面積的平均值（Ar）。另取高、中、低已知質量濃度（Cs）的益母草堿對照品溶液，不經處理直接進樣，得峰面積As。以前后2種處理測定得到的主峰峰面積之比（Ar/As）計算提取回收率，結果平均提取回收率為90.43%，RSD為6.71%（n=3）。

方法回收率試驗：取0.1 mL空白大鼠血漿，配制高、中、低3種不同質量濃度的質控樣品各5份，照2.2項下方法測定，帶入隨行標準曲線進行計算，考察相對回收率。結果平均回收率分別為93.63%，90.10%，101.24%。

穩定性試驗：取空白血漿0.1 mL，配制質量濃度為5.0 μg/mL的質控血漿樣品數份，分別于自動進樣器（5℃）中放置24 h，反復凍融3次，-80℃冰箱冷凍放置20 d，進行穩定性考察。高、中、低3個質量濃度于自動進樣器中放置0，2，4，8，12，16，24 h時測定含量的RSD為7.92%，反復凍融3次，測得的RSD為3.15%，-80℃冰箱冷凍放置0，5，15，20 d時測得的RSD為4.73%，表明益母草堿血漿樣品在上述條件下穩定性良好。

2.4 動物試驗

取SD大鼠8只，雌雄各半，體重180～200 g，服藥前禁食12 h，全程不禁水。次日晨尾靜脈注射益母草堿水溶液（5 g/L，加熱至37℃），給藥量為20 mg/kg。給藥4 h后統一進食。并于給藥前及給藥0.08，0.17，0.66，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，10.00 h時尾靜脈采血0.3 mL，以4 000 r/min的速率離心10 min，分離血漿，-80℃凍存待測。

2.5 藥代動力學參數

大鼠靜脈注射益母草堿后益母草堿的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。采用DAS 2.0藥動學程序對血藥濃度和時間數據進行擬合，益母草堿在大鼠體內變化過程符合二室模型，結果見表1。

圖2 大鼠靜脈注射益母草堿后平均血藥濃度-時間曲線（n=8）

表1 大鼠單劑量注射20 mg/kg益母草堿后的藥代動力學參數（n=8）

3 討論

益母草有效成分主要為益母草堿、水蘇堿、益母草定、益母草寧，目前已能通過合成獲得［6］，張金蓮等［7］研究了口服給藥后益母草堿及其代謝物在大鼠體內的藥代動力學和毒代動力學特征，發現益母草堿在大鼠體內的達峰時間為0.5～1.7 h，消除半衰期（t1/2）為2.1 h，具有吸收快和代謝快的特點，消除為線性動力學，體內主要以益母草堿葡萄糖醛酸結合物的形式存在。

本研究結果顯示，益母草堿在大鼠體內分布符合二室模型，靜脈注射給藥后，在大鼠體內的分布消除速度較快。

本研究中建立的測定血漿中益母草堿的HPLC法，樣品處理簡單，血漿中內源性物質及其他雜質對測定無干擾，方法回收率為90.10%～101.24%，日內、日間精密度RSD均小于10.00%，可用于益母草堿的藥代動力學和生物利用度研究。

［1］賀春暉，趙懿清，李霞，等.益母草堿藥理作用的分子機制研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2013，18（12）：1 419-1 423.

［2］錢海兵，徐玉平，羅魁.益母草堿對實驗性高脂血癥大鼠的降脂作用［J］.華西藥學雜志，2012，27（5）：528-530.

［3］李霞，陳飛虎，袁鳳來，等.益母草堿對藥物流產后大鼠子宮的作用研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2009，14（5）：481-486.

［4］Liu XH，Xin H，Hou AJ，et al.Protective effects of leonurine in neonatal rat hypoxic cardiomyocytes and rat infracted heart［J］.Clin Exp Pharmacol P，2009，36（7）：696-703.

［5］Loh KP，Qi J，Tan BK，et al.Leonurine protects middle cerebral artery occluded rats through antioxidant effect and regulation of mitochondrial function［J］.Stroke，2010，41（11）：2 661-2 668.

［6］Luo SS，Gu XF，Zhu YZ.Improved synthesis of leonurine as cardioprotective agent［J］.J Pharm Sci，2012，21（4）：292-295.

［7］張金蓮，劉洪瑞，毛煜，等.益母草堿及其代謝物在大鼠體內的毒代動力學研究［J］.中國醫藥工業雜志，2012，43（6）：451-454.

Determination of Concentration of Leonurine in Rat Plasma by HPLC and Its Pharmacokinetics

Yuan Chengjun1，Yuan Haoyu2，Yu Yu2，Wang Peng2
（1.Mianyang Municipal Central Hospital，Mianyang，Sichuan，China621000；2.Department of Pharmacy，416 Hospital of Nucleus Industry Ministry，Chengdu，Sichuan，China610051）

ObjectiveTo establish the HPLC method to detect the mass concentration of leonurine in rat plasma，and the pharmacokinetics was evaluated.MethodsThe mass concentration of leonurine in 8 rats was detected after intravenous injection of 20 mg/kg leonurine by HPLC.The mobile phase was acetonitrile-0.02 moL/L mono potassium phosphate（adjusting to pH=4.0 with phosphoric acid）=60∶40，at the flow rate of 1.0 mL/min and detected at 277 nm，the column temperature was 30℃.ResultsThe process of leonurine in rats fit two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters were followed：t1/2αwas（0.46±0.13）h，t1/2βwas（2.90±1.41）h，V was（0.46±0.07）L/kg，AUC（0-t）was（70.65±12.39）mg/（h·L）.ConclusionThis method was accurate，stable and sensitive，which can be used for the determination and pharmacokinetic of Leonurine.

leonurine；HPLC；pharmacokinetics

R285.5；R284.1

A

1006-4931（2015）20-0034-02

袁承軍，男，副主任藥師，研究方向為醫院藥學，（電子信箱）yuanchengjun0753@163.com；袁浩宇，男，副主任藥師，研究方向為醫院藥學，本文通訊作者，（電子信箱）yhy416@ 126.com。

2014-11-13；

2015-02-12）