電針對大鼠急性痛風性關節炎抗炎機制研究*

李躍兵 張 泓 李鐵浪 曾序求

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙410208）

電針對大鼠急性痛風性關節炎抗炎機制研究*

李躍兵 張 泓 李鐵浪 曾序求

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙410208）

目的 研究電針治療急性痛風性關節炎的作用機制。方法 SD大鼠40只，隨機分為空白對照組、模型組、電針組、雙氯芬酸鈉組，每組10只，空白對照組常規喂養，其余各組采用尿酸鈉溶液注射法建立痛風性關節炎大鼠模型。造模前2 d，空白對照組與模型組予以生理鹽水灌胃，雙氯芬酸鈉組予以雙氯芬酸鈉溶液灌胃，電針穴位組施以電針，各組均實驗前后測量大鼠踝關節周徑；蛋白印跡法、熒光定量PCR法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的蛋白和基因表達。結果 與空白對照組比較，模型組大鼠踝關節腫脹程度明顯增加，滑膜組織中TNF-α、IL-8蛋白和基因表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和雙氯芬酸鈉組可明顯減輕模型大鼠踝關節腫脹程度，抑制TNF-α、IL-8的蛋白和基因表達（P＜0.05或P＜0.01）；與電針組比較，雙氯酚酸組差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 電針具有良好的抗急性痛風性關節炎作用，能夠抑制TNF-α、IL-8基因和蛋白表達，以減輕組織的炎性損傷。

痛風性關節炎 電針 TNF-α IL-8

痛風是由長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起的一種代謝性風濕病。急性痛風性關節炎為痛風的典型表現形式［1］，是由于尿酸鹽沉積在關節囊、滑囊、軟骨、骨質和其他組織中引起關節劇烈的紅、腫、熱、痛和功能障礙等癥狀的疾病。隨著人民生活水平的提高，此病發生率有逐年上升的趨勢。以往治療此病常用非甾類抗炎藥，但由于副作用大，不良反應多，臨床使用常受限制。電針治療痛風性關節炎療效可靠［2］，可明顯減輕大鼠踝關節腫脹，減輕異物肉芽腫及局部軟骨組織的破壞，改善關節軟骨及滑膜組織的結構，抑制骨膠原纖維大量增生［3］，但其治病機理不明。本研究基于電針對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的蛋白和基因表達的影響，探討電針治療急性痛風性關節炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（清潔級），40只，雄性，體質量180～200 g。分籠飼養于湖南中醫藥大學動物中心實驗室，飼養溫度24～26℃，濕度50%～70%。

1.2 藥物與試劑 雙氯芬酸鈉（昆明制藥集團股份有限公司，批號：國藥準字J20140017），尿酸鈉晶體（美國Sigma公司，CASNumber：1198-77-2），戊巴比妥鈉 （江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品，批號：WS20130112），核蛋白提取試劑盒（thermo公司，批號：M10058），S-PRabbitHRPKit（DAB）兔Streptavidin-HRP試劑盒 （武漢博士德生物科技有限公司），TNF-α、IL-8mRNA引物 （上海捷瑞生物工程有限公司），TNF-α、IL-8抗體（Ancam公司）。

1.3 儀器 旋渦振蕩器（XW-80A），上海青浦瀘西儀器廠；手握式電動勻漿機（F6-10），德國FLUKO；低溫冷凍離心機（3K15），美國Sigma公司；移液器（Pipetman），吉爾森P型移液器；Real-time檢測儀 （ABI-7500），ABI；電泳儀 （miniprotean 3cell），BIORAD公司；電轉儀（PS-9），大連競邁科技有限公司；酶標儀（MK3），芬蘭雷勃酶標儀；水浴鍋（HI1210），Leic公司；暗匣（AX-Ⅱ型），粵華醫療器械，HM-6805-Ⅰ型經穴治療儀（恒明牌）；0.35mm×13mm毫針（華佗牌）等。

1.4 模型制備 疾病動物模型為病理性動物模型［4］，選用1%戊巴比妥鈉（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：WS20140112）腹腔注射麻醉，由大鼠右踝關節后側，6號注射針針口斜面與脛骨成45°夾角插入跟腱內側直至踝關節腔，將配制好的質量濃度為2.5 g/100mL尿酸鈉溶液100μL注入關節腔內，空白對照組用生理鹽水同法注射，以關節囊對側鼓脹為注入標準。

1.5 分組與干預 40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只。空白對照組按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，每日1次，連續2周；模型組，造模前2 d開始，按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，每日1次，連續2周；電針組，造模前2 d開始，參照《實驗針灸學》［5］取右側足三里、三陰交，毫針直刺，平補平瀉，進針后接經穴治療儀，電壓9V，電流強度1～3mA，頻率1.5～2Hz，疏密波，強度以大鼠局部皮膚肌肉微顫為度，留針20min，每日1次，連續2周；雙氯芬酸鈉組予雙氯芬酸鈉（生理鹽水溶解、稀釋）灌胃（1mg/kg），每日1次，連續2周。

1.6 標本采集及檢測 1）大鼠踝關節周徑測量。采用繞線法測量以標記筆標記大鼠右后肢踝關節，測量時，以自制絲線與右后肢紅圈重疊，然后在同一測量尺（最小刻度0.1 cm）上測量其長度，重復3次，取均值即為關節周徑。2）滑膜組織TNF-α、IL-8mRNA表達測定。提取滑膜組織mRNA，紫外分光光度計鑒定后逆轉錄［6］。TNF-α/IL-8反應體系：cDNA分別為2μL，20× SYBRGreen PCRMasterMix為32.5μL；去離子水分別為14.5μL；總體積50μL；95℃預變性10min；95℃變性15 s；退火延伸45 s，共40個循環。3）滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達測定。采用蛋白印跡法［7］（Western blot）提取滑膜組織的總蛋白，取含30μg總蛋白進行變性凝膠電泳。電轉至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉，分別與特異性抗大鼠抗體孵育（TNF-α1∶500；IL-8 1∶10），充分洗滌孵育，以HRP偶聯抗大鼠抗體，用ECL化學發光，X光片曝光顯影：以計算機掃描圖像進行分析，測定灰度值，即為蛋白的表達量，每個實驗重復3批不同的樣本。

1.7 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-T檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組痛風性關節炎大鼠踝關節腫脹程度比較見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠踝關節腫脹程度明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組及雙氯芬酸鈉組大鼠踝關節腫脹程度明顯減輕（P＜0.05）；電針組和雙氯芬酸鈉組之間差異無統計學意義 （P＞0.05）。

表1 各組痛風性關節炎大鼠踝關節腫脹程度比較（cm，±s）

表1 各組痛風性關節炎大鼠踝關節腫脹程度比較（cm，±s）

與空白對照組同時期比較，*P＜0.01；與模型組同時期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n 造模前 造模后空白對照組 10 2.82±0.15 3.13±0.13模型組 10 2.90±0.15 3.18±0.12*電針組 10 2.91±0.15 3.19±0.13△雙氯芬酸鈉組 10 2.75±0.11 3.09±0.19△

2.2 對痛風性關節炎大鼠踝關節滑膜組織TNF-α mRNA、IL-8mRNA表達的影響 見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠踝關節滑膜組織TNF-αmRNA、IL-8mRNA表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組及雙氯芬酸鈉組TNF-αmRNA、IL-8mRNA的表達明顯降低（P＜0.01）；電針組和雙氯芬酸鈉組之間差異無統計學意義（P＞0.05）

表2 各組痛風性關節炎大鼠踝關節滑膜組織TNF-mRNA、IL-8mRNA及TNF-α、IL-8蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組痛風性關節炎大鼠踝關節滑膜組織TNF-mRNA、IL-8mRNA及TNF-α、IL-8蛋白表達水平比較（±s）

與電針組比較，▲P＜0.01。

組 別 n TNF-αmRNA（μL） IL-8mRNA（μL） TNF-α蛋白（μg）IL-8蛋白（μg）空白對照組 32.45±1.48 4.53±2.48 0.53±0.03 0.21±0.01模型組 37.97±3.54* 10.50±2.81* 1.08±0.04* 0.40±0.07*電針組 34.65±1.58△△ 5.19±4.20△△ 0.80±0.04△△ 0.33±0.03△△雙氯芬酸鈉組 33.97±0.78△△ 6.00±2.53△△ 0.32±0.02△△▲ 0.32±0.03△△

2.3 對痛風性關節炎大鼠踝關節滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達的影響 見表2。空白對照組大鼠踝關節滑膜組織有少量TNF-α、IL-8蛋白表達，與空白對照組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和雙氯芬酸鈉組TNF-α、IL-8蛋白表達明顯減少 （P＜0.01），電針組和雙氯芬酸鈉組之間比較，TNF-α蛋白表達雙氯芬酸鈉組低于電針組（P＜0.01），IL-8蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

急性痛風性關節炎屬中醫“濕熱痹”范疇，常因飲食不節傷及脾胃，脾失健運而濕濁內生，或平素體虛感受濕熱之邪，邪氣壅于經絡，痹阻氣血經脈，并滯留于關節筋骨，從而出現關節疼痛、腫大、活動不利等癥狀。本病屬正虛邪實之候，治療應從脾腎入手，采用補虛瀉實法。《針灸甲乙經》云“足下熱痛不能久坐，濕痹不能行，三陰交主之”。三陰交位于脾經，又為足三陰經交會穴，有清熱健脾利濕；而足三里為胃經的要穴，有補益肝腎之功效。

急性痛風性關節炎是原發性痛風最常見的首發癥狀，好發于下肢關節。目前研究認為，急性痛風性關節炎為尿酸鈉結晶體在關節及周圍組織沉積所引起的急性炎癥反應［8-10］。尿酸鈉沉積于滑膜細胞，與滑膜液中的IgG結合，被白細胞及滑膜細胞吞噬，促使這些細胞釋放組胺，凝血因子，補體及花生四烯酸等物質花生四烯酸通過環氧化酶和脂氧化酶兩條途徑分別生成前列腺E2及白三烯，后者刺激TNF-α、IL-8產生，進而引起局部血管擴張，通透性增加、滲出、水腫、白細胞聚集、發熱等炎癥反應。TNF-α、IL-1β是炎癥網鏈中的一級細胞因子，而IL-8是由TNF-α、IL-1β誘導的二級前炎癥細胞因子［11］。大量實驗研究發現［12］，在尿酸鈉導致痛風性關節炎的實驗模型中檢測出TNFmRNA高表達，由于TNF可增強中性粒細胞的活性而使IL-1釋放，所以TNF在尿酸鈉結晶沉積中發揮重要作用，因此，TNF-α、IL-8作為炎癥反應趨化因子和激活因子在急性痛風性關節炎的發生和發展過程中起著重要作用，并與疾病的進展及預后密切相關。本研究結果顯示，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠踝關節腫脹程度仍明顯增加，電針及雙氯芬酸鈉可明顯減輕模型大鼠踝關節腫脹程度，同時TNF-α、IL-8基因及蛋白表達水平明顯低于模型組，說明電針能夠抑制大鼠炎癥細胞因子基因及蛋白表達，減輕局部炎癥，發揮抗炎作用。

綜上所述，電針治療急性痛風性關節炎療效肯定，為其在臨床的應用提供了科學依據。

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Mechanism Study of Electroacupuncture in Rats with Acute Gouty Arthritis

LI Yuebing，ZHANG Hong，LI Tielang，et al. College of Acupuncture&Moxibustion and Tui-na，Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China

Objective：To study the mechanism of action of electric acupuncture treatment in acute gouty arthritis.Methods：40 Wistar rats were randomly divided into the blank control group，the model group，the electric acupuncture group，the diclofenac sodium group with 10 rats in each group.Regular feeding was used in the blank control group，the remaining groups on uric acid sodium solution injections gouty arthritis rat model was established.Made 2 days before the mold and blank control group and model group give saline lavage，diclofenac sodium group diclofenac sodium solution to fill the stomach，electric acupuncture meridians to electric acupuncture group，each group were measured before and after the experiment rats ankle weeks diameter；Protein imprinting method，fluorescence，the protein and gene（quantitative PCR method to detect TNF-（expression of IL-8.Results：Compared with blank control group，model group rats ankle swelling degree increased significantly.The TNF-α and the IL-8 protein and gene expressions were significantly higher（P＜0.01）.Compared with model group，the curative group and diclofenac sodium group can obviously reduce the model rats ankle.The TNF-α and IL-8 protein and gene expressions were inhibited remarkably（P＜0.05，P＜0.01）.Compared with electric acupuncture group，there was no statistically significant difference double phenolic acid group（P＞0.05）.Conclusion：The curative effect of electric acupuncture in acute gouty arthritis can inhibit TNF-α and IL-8 gene and protein expressions in order to alleviate the inflammatory tissue damage.

Gouty arthritis；Electric acupuncture；TNF-α；IL-8

R245.9+7

A

1004-745X（2015）05-0781-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.010

2015-01-03）

湖南省教育廳科學基金項目（14C0855）