丁苯酞預處理對腦缺血再灌注大鼠海馬微血管構筑和自由基代謝的影響

鄭小影，孔維，趙淑敏，紀海茹，陳萌，馬衛軍，韓莉，劉勝

丁苯酞預處理對腦缺血再灌注大鼠海馬微血管構筑和自由基代謝的影響

鄭小影，孔維，趙淑敏△，紀海茹，陳萌，馬衛軍，韓莉，劉勝

目的觀察局灶性腦缺血再灌注時大鼠海馬微血管構筑和自由基代謝的變化，探討丁苯酞對其影響。方法54只SD大鼠按隨機數字表法分為丁苯酞預處理組、缺血再灌注組和假手術組，每組18只。線栓法制備大鼠右側大腦中動脈栓塞模型，觀察神經功能缺損評分和梗死體積；單寧酸-氯化鐵（TA-Fe）媒染法顯示海馬微血管，定量分析微血管密度（MVD）和微血管面積密度（MVA）；比色法檢測海馬組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結果與缺血再灌注組相比，丁苯酞預處理組神經功能缺損評分和梗死體積均減少，SOD活性升高、MDA含量下降，微血管數量增多，分支吻合成網，MVD和MVA值明顯升高（P＜0.01）。結論丁苯酞可改善海馬微血管分布，減輕自由基損傷，對局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的預防性保護作用。

再灌注損傷；海馬；超氧化物歧化酶；丙二醛；丁苯酞；微血管密度；微血管面積密度

隨著社會的發展和生活節奏的加快，急性腦梗死患者逐年增多且呈現年輕化趨勢。其病理生理基礎主要是腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia re?perfusion injury，CIRI），這使尋找可靠藥物來抑制CIRI成為國內外醫生面臨的主要難題之一。丁苯酞（3-n-butylphthalide，商品名恩必普，NBP）已被證明對CIRI有較好的治療作用［1］。但其作為預防用藥的效果和機制尚有待進一步研究。本文通過觀察大鼠腦缺血再灌注時海馬微血管分布和超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）代謝情況，探討丁苯酞對急性腦梗死的預防性保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與分組54只SPF級SD大鼠購自天津醫科大學實驗動物中心，體質量200～240 g，按隨機數字表法分為丁苯酞預處理（NBP）組、缺血再灌注（IR）組和假手術（Sham）組，每組18只。丁苯酞購自石藥集團恩必普藥業有限公司。NBP組給予40 mg·kg-1·d-1灌胃，Sham組和IR組給等容積的生理鹽水，共7 d。Mivnt圖像分析系統（山東）；SOD、MDA、DAB顯色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；單寧酸、氯化鐵（市凱通化學試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠缺血再灌注模型制備大鼠適應性飼養1周后，各組大鼠灌胃7 d，準備漁線（一端涂凡士林，一端用記號筆做好標記備用）。術前12 h禁食、自由飲水，IR組和NBP組采用Zea-Longa改良線栓法［2］制備右側大腦中動脈閉塞（MCAO）2 h再灌注24 h模型。Sham組僅分離頸總、頸內、頸外動脈，不做插線處理。大鼠蘇醒后模型成功標志為：右眼Horner征、行走時向左側傾倒或轉圈和提尾時左前肢屈曲內收。不符合模型要求的剔除，并及時補遺。術后分籠保暖飼養。

1.2.2 神經功能缺損評分參照Longa等［2］評分標準，于腦缺血2 h再灌注24 h時對各組大鼠進行神經功能缺損評分。無神經功能缺損癥狀0分；不能完全伸展對側前爪1分；向外側轉圈2分；向內側傾倒3分；不能自發行走，意識喪失4分。1～3分留用，0分、4分者棄去，并及時補足。

1.2.3 腦梗死體積測定采用TTC染色法。大鼠缺血2 h再灌注24 h時，每組取6只斷頭取腦。將新鮮的腦組織置于-20℃冰箱中速凍后，沿冠狀方向切成片厚約2 mm切片。在培養皿中將切片擺好，倒入2%TTC溶液，37℃恒溫箱避光孵育30 min，期間翻動以保證切片均勻著色，甲醛固定后拍照。正常腦組織染成均勻玫瑰紅色，梗死區因缺血不著色而呈白色。圖像分析系統計算每片的梗死面積，梗死體積即為梗死面積之和與片厚的乘積，以梗死體積/全腦體積比值作為衡量參數。

1.2.4 海馬微血管的顯示及定量分析再灌注后24 h，每組大鼠取6只，采用含2%單寧酸的混合固定液灌注固定后取腦。震蕩切片機連續切片，片厚25 μm，隔2片取1片。TAFe聯合媒染法［3］顯示海馬微血管形態后光鏡下觀察并拍片。隨機讀取3個視野，Mivnt圖像分析系統定量分析各組大鼠海馬的微血管密度（microvesser density，MVD）和微血管面積密度（microvesser aera density，MVA），取平均值。

1.2.5 海馬組織SOD活性和MDA含量的測定再灌注24 h后，每組大鼠取6只，斷頭取腦。在冰盤上將右側海馬從新鮮腦組織分離出來并制成10%勻漿備用。操作流程和方法按試劑盒要求進行。黃嘌呤氧化酶法測SOD活性，硫代巴比妥酸法測MDA含量。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0軟件處理，結果以表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗；2組間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分Sham組無神經功能缺損，IR組可見明顯的右側Horner征和行走時向左側轉圈現象，見圖1、2。與IR組相比，NBP組神經功能缺損癥狀顯著減輕（P＜0.01），見表1。

2.2 各組大鼠腦梗死體積百分比的比較Sham組腦組織染成均勻玫瑰紅色，IR組和NBP組均有不同范圍的蒼白色梗死灶。與IR組相比，NBP組的蒼白色范圍有較顯著的降低（P＜0.01），見表1。

Fig.1Horner symptoms in the right圖1 右側Horner征

Fig.2Circling towards to the left圖2 向左轉圈

Tab.1Comparision of neurological scores and the infarction volume of rats in all three groups表1 各組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積比較（n=6）

Tab.1Comparision of neurological scores and the infarction volume of rats in all three groups表1 各組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積比較（n=6）

＊＊P＜0.01

組別Sham組IR組NBP組t神經功能缺損評分0 2.99±0.36 1.42±0.19 9.431＊＊腦梗死體積（%）0 9.66±0.97 3.99±0.69 11.670＊＊

2.3 大鼠海馬微血管顯示及定量分析Sham組海馬微血管呈現空心管狀密集分布，發出分支并相互吻合成網；IR組多數血管扭曲變形或閉合，分支及分支間吻合幾乎看不到，MVD、MVA均明顯降低，與Sham組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；NBP組的微血管數量和樹狀分支較多，形態自然，與IR組相比，MVD、MVA均增加（P＜0.01），見表2、圖3。

Tab.2Comparison of MVD and MVA in Hippocampus of rats in all three groups表2 各組大鼠海馬的MVD與MVA變化（n=6）

Tab.2Comparison of MVD and MVA in Hippocampus of rats in all three groups表2 各組大鼠海馬的MVD與MVA變化（n=6）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與IR組比較，P＜0.01

組別Sham組IR組NBP組F MVD 47.04±3.15 10.88±0.97a 28.66±2.14ab 380.681＊＊MVA 0.118 1±0.012 8 0.025 8±0.007 4a 0.066 8±0.007 7ab 137.898＊＊

2.4 各組大鼠海馬組織SOD活性和MDA的含量與Sham組相比，IR組海馬組織的SOD活性明顯降低，而MDA含量顯著升高（P＜0.01）；NBP預處理有效上調了SOD活性，同時下調了MDA含量，與IR組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

Tab.3Changes of SOD and MDA in hippocampus of rats in all three groups表3 各組大鼠海馬組織的SOD活性與MDA含量比較（n=6）

Tab.3Changes of SOD and MDA in hippocampus of rats in all three groups表3 各組大鼠海馬組織的SOD活性與MDA含量比較（n=6）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與IR組比較，P＜0.01

組別Sham組IR組NBP組F SOD（U·mg-1·pro-1）140.84±3.07 95.22±3.35a 123.59±2.28ab 368.640＊＊MDA（μmol·g-1·pro-1）9.03±0.84 15.10±0.75a 11.41±0.81ab 87.231＊＊

Fig.3Microvascular architecture in hippocampus of rats in all groups（TA-Fe method，×200）圖3 各組大鼠海馬微血管構筑（TA-Fe媒染法，×200）

3 討論

急性腦梗死時血流急劇中斷可引起神經功能缺損，早期溶栓又會加重這種損傷。因此，通過對動物模型預防用藥來減輕或抑制這種缺血再灌注損傷的實驗成為醫學科研人員一個主要研究方向。研究證實預防性應用中藥黃芩莖葉總黃酮可有效減輕大鼠大腦中動脈的CIRI時皮質微血管損傷［4］、提高抗氧化能力，并抑制神經元凋亡［5-6］。紀海茹等［7］應用我國自主研發新藥丁苯酞（商品名稱：恩必普）預處理局灶性腦缺血再灌注大鼠也證實其可減輕CIRI造成的腦水腫并降低血腦屏障通透性。?；燮G等［8］研究顯示丁苯酞氯化鈉注射液治療臨床急性缺血性卒中有較好療效。但丁苯酞作為臨床一級預防用藥的依據尚不完善，有待進一步研究。

3.1 NBP對大鼠CIRI時海馬微血管構筑的作用腦組織對缺血缺氧非常敏感，海馬作為最敏感部位之一，海馬微循環因其維持海馬血液與神經元間的物質交換而備受關注，微血管的數量、結構和功能的完整性是有效血液供應的保證。CIRI可以破壞毛細血管管壁完整性，從而改變其通透性，引發一系列的病理生理變化。顯示微血管的方法很多，而單寧酸-氯化鐵法［3］可更好地顯示微血管。用其觀察缺血再灌注大腦皮質的微血管變化效果良好［4］。MVD、MVA是衡量微循環物質交換功能狀態和局部血流量的主要參數，本實驗顯示Sham組海馬管狀微血管密集，分支很多且相互吻合成網；而IR組毛細血管很少，分支及分支間的吻合少見，MVD、MVA均明顯降低；NBP組的毛細血管數量和分支增多，MVD、MVA均較IR組增加。說明丁苯酞對海馬CIRI的保護作用可能與丁苯酞能促進CIRI的腦微血管側支循環的形成有關，這與以往的報道一致［9］。

3.2 NBP對大鼠CIRI時海馬組織自由基代謝的影響CIRI的病理過程涉及許多因素，其中氧自由基占有重要地位。生理狀態下機體內氧自由基的產生和清除處于動態平衡狀態，CIRI時產生的大量氧自由基可造成脂質過氧化物蓄積，細胞膜受損，最終引起神經功能缺損［10］。SOD是體內重要的天然抗氧化酶，MDA是由氧自由基引發的脂質過氧化產物，MDA的含量一定程度上可以反映機體的脂質過氧化程度。因此，監測CIRI時SOD活性和MDA含量成為評價此時機體內氧化和抗氧化水平的經典指標。陳萌等［5］發現大鼠CIRI時SOD活性明顯下降，而MDA含量大幅上調，說明CIRI時氧自由基致膜脂質等損傷，從而引發一系列的腦細胞功能受損。本文用丁苯酞預處理實驗大鼠發現NBP組較IR組SOD活性升高，MDA含量下降，提示丁苯酞可能通過調節自由基代謝來減輕CIRI。

綜上所述，本文通過分析丁苯酞預處理對大鼠局灶性CIRI海馬的微血管分布和自由基代謝的影響，證實其對CIRI有一定的預防性保護作用，為其成為臨床預防用藥提供了實驗依據。

［1］Yan HY，Xi HY，Wang HM，et al.Treating massive cerebral infarc?tion by butyl phthalide：a research on clinical application［J］.Chi?nese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2014，34（3）：127-129.［閆海燕，郗紅艷，王紅梅，等.丁苯酞治療大面積腦梗死的臨床應用研究［J］.中國生化藥物雜志，2014，34（3）：127-129］.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cere?bral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.doi：10.1161/01.STR.20.1.84.

［3］Zhao SM，Kong XY.A new method of mordant dyeing vessel：tannic acid ferric chloride［J］.Chinese Journal of Anatomy，2001，24（1）：91-92.［趙淑敏，孔祥玉.一種媒染血管的新方法—單寧酸-氯化鐵法［J］.解剖學雜志，2001，24（1）：91-92］.

［4］Zheng XY，Kong W，Kong XY，et al.Protective effect of scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid on injury of microvascular ar?chitecture and lipid peroxidation induced by cerebr-al ischemia re?perfusion cortex in rats［J］.Chinese Journal of Anatomy，2012，35（2）：198-200.［鄭小影，孔維，孔祥玉，等.黃芩莖葉總黃酮預處理對大鼠缺血再灌注腦皮質微血管構筑和脂質過氧化損傷的保護作用［J］.解剖學雜志，2012，35（2）：198-200］.

［5］Chen M，Zhao SM，Li H，et al.Effect of scutellaria baicalensis stemleave total flavonoid on Fas and FasL expression and anti-oxidation in hippocampal neurons of rats Induced by focal ischemia reperfu?sion［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formu?lae，2013，19（4）：228-231.［陳萌，趙淑敏，李涵，等.黃芩莖葉總黃酮預處理對腦缺血再灌注大鼠海馬Fas，FasL的表達和抗氧化能力的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：228-231］.

［6］Zhao SM，Kong W，Zhang SF，et al.Pretreatment with scutellaria ba?icalensis stem-leaf total flavonoid prevents cerebral ischemia-re?perfusion injury［J］.Neural Regen Res，2013，8（34）：3183-3192.doi：10.3969/j.issn.1673-5374.2013.34.002.

［7］Ji HR，Kong LW，Kong W，et al.Effect of pretreatment with NBP on brain edema and blood brain barrier in rats during cerebral isch?emia reperfusion injury［J］.J Apoplexy and Nervous Diseases，2014，31（8）：698-700.［紀海茹，孔令偉，孔維，等.丁苯酞預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦水腫和血腦屏障的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2014，31（8）：698-700］.

［8］Niu HY，Zhang ZQ，Wang H，et al.An observation study on the cu?rative effect of butylp-hthalide sodium chloride combined with uro?kinase in the treatment of acute ischemic stroke［J］.Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2014，14（9）：820-823.［牛慧艷，張占強，王海，等.丁苯酞氯化鈉注射液聯合尿激酶治療急性缺血性卒中療效觀察［J］.中國現代神經疾病雜志，2014，14（9）：820-823］.doi：10.3969/ j.issn.1672-6731.2014.09.013.

［9］Li M，Sun W，Lian XG，et al.Butylphthalide improves cerebrovascu?lar reactivity in patients with severe intracranial internal carotid ar?tery［J］.Guo Ji Nao Xue Guan Bing Za Zhi，2011，19（11）：824?828.［李敏，孫文，練學淦，等.丁苯酞改善重度頸內動脈顱內段狹窄患者的腦血管反應性［J］.國際腦血管病雜志，2011，19（11）：824-828］.doi：10.3760/cma.j.issn.1673-4165.2011.11.005.

［10］Wang W，Qu Y，Jia WG，et al.Effect of Naoduqing Granules on SOD，MDA and hs-CRP contents in model rats with cerebral isch?emia-reperfusion injury［J］.Journal of Emergency in Traditional Chi?nese Medicine，2014，23（9）：1605-1606，1632.［王巍，曲穎，賈維剛，等.腦毒清顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、MDA及hs-CRP含量的影響［J］.中國中醫急癥，2014，23（9）：1605-1606，1632］.

（2014-11-24收稿2015-03-07修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of 3-n-butylphthalide pretreatment on microvascular architecture and free radical metabolism in hippocampus induced by cerebral ischemia/reperfusion

ZHENG Xiaoying，KONG Wei，ZHAO Shumin△，JI Hairu，CHEN Meng，MA Weijun，HAN Li，LIU Sheng
Basic Medical College，Chengde Medical College，Chengde 067000，China△

ObjectiveTo observe microvascular architecture and free radical metabolism in hippocampus after focal cerebral ischemia/reperfusion and to explore the effect of NBP（3-n-butylphthalide）.MethodsFifty-four SD rats were ran?domly divided into NBP pretreatment group，ischemia/reperfusion group and sham operation group（n=18 in each group）.The model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by suture method.The neurological scores were counted and the volume of infarction was measured；TA-Fe method was applied to observe the microvascular architecture of hippo?campus，Mivnt image analysis system was used to analyze the microvessel density（MVD）and the microvessel area density（MVA）of hippocampus quantitatively；The activity of SOD and content of MDA were measured by colorimetric method.ResultsCompared to the ischemia reperfusion（IR）group，the neurological scores and the volume of infarction were decreased sharply in NBP group.What′s more，the activity of SOD，MVD and MVA were all enhanced but the content of MDA and the count of closed microvessels were both reduced（P＜0.01）.ConclusionNBP can improve microvascular architecture of hippocampus and reduce the free radical injury.There is a protective effect on hippocampus of rats who suffered focal cere?bral ischemia reperfusion.

reperfusion injury；hippocampus；superoxide dismutase；malondialdehyde；3-n-butylphthalide；microves?sel density；microvessel area density

R743

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.010

河北省教育廳教育科學計劃項目（JYGH2010048）

承德醫學院基礎醫學院（郵編067000）

鄭小影（1980），女，碩士研究生，主要從事中樞神經解剖方面研究

△通訊作者E-mail：zhaoshumin-2008@163.com